本文來源于：細胞與基因治療領域

2022 年 12 月底，美國眾議院批準了《FDA 現(xiàn)代化法案 2.0（FDA Modernization Act 2.0）》，F(xiàn)DA 不再對新藥和仿制藥的動物試驗做強制要求，旨在倡導減少動物試驗的使用，鼓勵在可行的情況下逐步應用替代模型。

類器官是一種三維（3D）細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，已被證明是臨床前研究中動物模型的絕佳替代品。在 FDA 政策的推動下，我們可以屢屢見到國內(nèi)外類器官和器官芯片獲得融資，這一應用方向已成為生物醫(yī)藥投融資的一大熱點。

近 10 年來，類器官市場顯著增長。2010-2020 年期間，新公司增長率高達 64%；截至 2022 年 Q4，該領域的累計市場價值約為 10.31 億美元。

2010-2022 年期間類器官市場的企業(yè)數(shù)量、市場份額

類器官是利用多能干細胞、成體干細胞等進行體外定向誘導與 3D 培養(yǎng)而形成的組織器官類似物，可以模擬體內(nèi)組織的復雜結構及功能的許多方面，干細胞誘導生成的類器官可以用于人體組織發(fā)育、再生和修復機制方面的基礎研究，也可以用于診斷、疾病建模、藥物篩選評價與臨床再生醫(yī)學等【1，2】。此前，Nature Methods 評價類器官技術：利用干細胞誘導生成的三維組織模型，為人類生物學研究提供了強大的方法。迄今為止，文獻等資料已經(jīng)報道了許多干細胞誘導生成類器官培養(yǎng)方面的工程策略。

本文在總結前人資料的基礎上，概述了干細胞誘導生成類器官的培養(yǎng)方法，并簡要討論了干細胞培養(yǎng)誘導生成類器官的關鍵因素，例如細胞的來源、細胞外基質和細胞因子等。

目前，按照來源，類器官主要分為三大類：
① 多能干細胞來源類器官；
② 成體干細胞來源類器官；
③ 腫瘤組織來源的腫瘤類器官。

就類器官培養(yǎng)的初始組織細胞來源而言，盡管有報道稱，將人腎癌、甲狀腺癌、結腸癌、肝癌、肺癌和腎癌組織切碎，在液氮中保存一年多時間之后進行復蘇及原代細胞的分離提取，對細胞進行 3D 培養(yǎng)，結果表明組織凍存對于細胞活力及生長速度等無顯著影響【3】。但人們?nèi)云毡檎J為未經(jīng)凍存的新鮮組織是類器官培養(yǎng)的最佳選擇。

類器官的制備是一項較為復雜的工程，類器官制備的經(jīng)典流程是將分離出來的干細胞培養(yǎng)在 3D 支架上，并向培養(yǎng)環(huán)境中添加例如表皮生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF）、成纖細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）等在內(nèi)的多種生長因子及其它添加物來促進相應類器官形成與生長，最后要對類器官進行鑒定。

圖 1. 干細胞來源類器官培養(yǎng)流程示意圖

干細胞誘導生成類器官需要特定的試劑耗材等物質條件（例如：特定的生長因子、3D 支架和干細胞分化誘導物等）與特定的培養(yǎng)條件（例如合適的溫度、合適的氧氣濃度、二氧化碳濃度以及一些模擬體內(nèi)情況的特定力學參數(shù)等），這些是為干細胞誘導生成類器官構建一個適合其生長發(fā)育復雜微環(huán)境的極其重要條件【1】。

1、類器官多種培養(yǎng)模式
鑒于不同物理環(huán)境條件對于干細胞組織發(fā)育成類器官至關重要，目前針對干細胞誘導生成類器官的不同培養(yǎng)需求開發(fā)出了多種不同物理環(huán)境狀態(tài)下的培養(yǎng)模式，例如采用天然細胞外基質 3D 支架進行靜態(tài)培養(yǎng)（如小腸類器官）、采用無細胞外基質支架支撐的 3D 懸浮攪拌式培養(yǎng)（如腦類器官）、采用氣-液界面細胞團培養(yǎng)（如類腎器官）等（見圖 2）。

圖 2. 不同物理環(huán)境狀態(tài)下的類器官培養(yǎng)【4】

其中，細胞外基質為類器官細胞生長提供合適的 3D 支架，類器官細胞外基質通過基質膠制備，基質膠在類器官制備成本中的占比較高，目前常用的基質膠為美國 BD Biosciences 公司的 Matrigel®，一方面價格較高，一方面由于其來源于小鼠肉瘤細胞系，基質膠批次間差異問題可能導致不同實驗或類器官產(chǎn)品間的質量不一，且成分復雜、含未知的生物成分、免疫原性等問題，為基礎研究或臨床轉化帶來一定困難，因此，體外合成的低成本、非動物細胞來源的細胞外基質將是類器官行業(yè)需要解決的重要問題之一。

但靜態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)條件下，對供養(yǎng)和營養(yǎng)物質的供給較為困難，尤其是大體積類型的器官【5】。可以選擇性使用上述提到的攪拌式動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)，它可以為較大體積的類器官提供充足的氧氣交換和營養(yǎng)物質，促使類器官的發(fā)育和維持。

2、合適的生化微環(huán)境至關重要
合適的生化微環(huán)境在干細胞誘導生成類器官與類器官穩(wěn)態(tài)維持方面扮演重要角色，各類細胞因子或一些誘導物對于維持干細胞的分化、類器官的發(fā)育及穩(wěn)態(tài)所需的微環(huán)境至關重要，根據(jù)干細胞來源不同或制備的類器官種類不同，所需的添加物或細胞因子種類或組合也不同，即使結構非常相近的組織器官，其所需的添加物或細胞因子組合也不盡相同。就細胞因子而言，經(jīng)典的細胞因子組合方案為 WENR（縮寫 WENR 為四種細胞因子 Wnt- 3a、EGF、Noggin 和 R-Spondins 分別取首字母后的組合），這四種細胞因子的增減組合適用于絕大部分的類器官培養(yǎng)實驗。

① Wnt 信號通路是一個非常復雜的蛋白質相互作用系統(tǒng)，在調節(jié)細胞發(fā)育、增殖分化、粘附及自我更新等多方面發(fā)揮重要功能，參與此信號通路的 Wnt 蛋白構成了一個龐大的分泌蛋白家族。其中最具代表性的 Wnt3a 細胞因子，在機體內(nèi)分布廣泛，在調控細胞更新、增殖、分化與運動等方面至關重要，是類器官培養(yǎng)最常用的細胞因子之一。

② EGF 是目前發(fā)現(xiàn)的 EGFR 的主要配體之一。由于 EGF 配體與細胞外受體（例如 EGF）相結合，EGFR 二聚體化引起胞內(nèi)域形成酪氨酸激酶活化，激活下游信號通路，經(jīng)信號的級聯(lián)反應，最終信號傳遞至細胞核，調控相應基因的表達，進而控制細胞生長分裂、分化、遷移與粘附等生理活動。EGF 是胃腸道、甲狀腺、肝臟、腦等多種類器官培養(yǎng)所需的細胞因子。

③ R-Spondin 家族是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的 Wnt 激活劑，其家族由 4 個成員，即 R-Spondin-1 、R-Spondin-2 、R-Spondin-3 和 R-Spondin-4 組成。Wnt-R-Spondin-1 信號通路在類器官培養(yǎng)中特別重要。此信號通路的胞外 Wnt 配體需結合 Frizzled 和 Lrp5/6 而被活化，而細胞中的泛素化降解機制會降解 Frizzled，使得 Wnt 信號通路被抑制，R-spondin 可以抑制 Frizzled 的泛素化進而促進 Wnt 通路的活化【6】，因此在類器官培養(yǎng)過程中往往 Wnt-3a 和 R-Spondin 兩種細胞因子需要同時添加。

④ Noggin 是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)的拮抗劑，在胚胎早期發(fā)育，四肢形成和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起重要作用，Noggin 作為 Wnt 信號通路及 BMP 信號的重要調控因子，在眾多組織器官發(fā)育過程中起著重要作用。

3、類器官的鑒定
由于體外干細胞誘導生成的類器官與其對應的體內(nèi)組織的一致性是決定類器官質量的關鍵，因此，要對類器官進行鑒定。初步鑒定可使用顯微鏡和 H&E 染色方法觀察形態(tài)，評估類器官與體內(nèi)對應組織器官是否具有相似的組織學形態(tài)特征；之后可采用蛋白質免疫印跡（WB）、qPCR、ELISA、流式細胞術、IHC 等檢測類器官是否表達預期的 Biomarker；類器官細胞基因情況鑒定也是必要的，通過基因測序和轉錄組測序可以鑒定類器官是否有某些基因缺失突變及表達譜特征；此外，對于一些類器官，可檢測其是否具有預期功能，例如：腸類器官細胞 CFTR 活性功能檢測、心臟類器官是否可以自主跳動等。