隨著科學研究的不斷深入，對顯微鏡技術的要求也日益提高。傳統光學顯微鏡雖然廣泛應用，但在成像深度和分辨率方面逐漸難以滿足前沿研究的需求。而雙光子熒光（TPF）顯微成像技術的出現，打開了一扇通往更高分辨率和更深成像深度的大門。這種技術基于非線性光學效應，具有許多獨特的優勢，使其在眾多顯微成像技術中脫穎而出，成為化學、醫藥學和生命科學領域的研究熱點。

河北工業大學張澤團隊利用飛秒激光器作為激發光源，搭建了TPF顯微成像系統。使用該系統測量了TPF光譜，實現了對小鼠大腦切片的激發，開展了小鼠大腦切片的斷層掃描成像與三維重構實驗。在實驗中采用主客觀分析相結合的研究方法，通過對三維圖像的觀測后再對樣品關鍵部位的熒光強度分布進行分析，可以快速鎖定研究區域。在以往的成像研究中常采用直接觀察圖像并結合光譜的方法對樣品中特定細胞或組織進行定性的分析，卻少有研究通過處理強度分布數據來對樣品的關鍵部位進行定量的分析。

成像理論與實驗
一、成像理論基礎
1.雙光子熒光空間分布
通過對高斯光束復振幅在空間中的分布進行分析，推導出TPF信號的縱向與徑向分布公式，揭示了TPF信號強度在空間中的變化規律，為理解成像系統的分辨率和成像深度提供了理論依據。

2.成像深度與分辨率
成像深度與激發光在組織中的散射長度、熒光量子效率、熒光收集效率以及激發光脈沖的重復頻率和脈沖寬度等有關，通過合理調整這些參數，可以增加成像深度。而分辨率方面，橫向分辨率與激發光波長、物鏡數值孔徑等因素相關，根據相關公式計算出本實驗中成像系統的理論橫向分辨率為453nm，縱向分辨率為2.087μm。

2.小鼠大腦切片的TPF顯微成像實驗操作步驟
首先測量羅丹明B溶液的TPF光譜，選擇合適的探測窗口。在進行小鼠大腦切片成像時，將樣品放置于電動平臺，調整焦距和增益檔位，選擇成像區域。通過掃描光路對樣品進行二維掃描，激發熒光并采集信號，最后由電腦處理得到顯微成像結果。在實驗過程中，還對不同激發功率下的成像結果進行分析，研究熒光強度與激發功率的關系。

研究結論
一、成像系統性能參數的精確測定
1.成像深度的深度剖析
通過嚴謹的實驗和數據分析，確定了成像系統的成像深度。數值的得出并非偶然，而是在對小鼠大腦切片進行細致的三維重構實驗以及對樣品關鍵部位熒光強度數據深入分析的基礎上獲得的。在實驗過程中，我們從樣品表面到14μm深度范圍內對小鼠大腦切片沿Z軸進行了斷層掃描成像，每采集一次圖像向下移動1μm的距離，如同在微觀世界中逐層揭開大腦的神秘面紗。

通過對不同深度處熒光強度的精確測量和分析，我們發現隨著深度的增加，熒光強度呈現出一定的變化規律，而在12.9μm深度之后，成像系統采集到的信號主要為噪聲，這表明該深度是成像系統能夠有效獲取有用信息的極限，從而準確界定了成像深度。這一成像深度的確定為我們在研究小鼠大腦以及其他類似生物樣品時提供了一個重要的參考指標，幫助我們了解該成像系統能夠深入探測樣品內部結構的程度。

2.橫向分辨率的精準評估
采用了一種巧妙的方法：在小鼠大腦切片樣品中尋找不含組織細胞的狹窄縫隙，通過分析成像結果中這些縫隙位置的強度分布曲線，確定能夠分辨的最小距離，從而得出橫向分辨率。盡管實驗中得到的橫向分辨率數值大于理論計算的453nm，但這一結果仍然反映了成像系統在實際應用中的分辨能力。由于樣品中可能不存在間距剛好為最小分辨率的理想縫隙，所以實際測量值會受到一定限制，但這也為我們進一步優化實驗方法和提高分辨率提供了方向。

二、小鼠大腦微觀結構成像的重要發現
1.灰質與白質分布的清晰呈現
實驗清晰地展示了小鼠大腦中灰質與白質在不同深度的分布情況。在樣品表面，灰質部分相較于白質具有更高的熒光強度，這一現象表明灰質在該區域可能具有更為活躍的分子活動或者更高的物質密度。隨著深度的增加，灰質部分的熒光強度逐漸減弱，而白質部分的熒光強度開始增加，在3μm的深度，白質的熒光強度開始高于灰質部分，在6μm的深度，灰質部分的熒光信號幾乎消失，強度僅為白質部分的1/18。

這一系列變化揭示了小鼠大腦內部結構的復雜性和層次性。灰質主要存在于樣品的淺層，這與灰質在大腦中承擔的重要功能密切相關，如信息處理、認知和感知等功能可能主要在淺層灰質區域進行。而白質部分厚度更大且縱向分布更廣，這與白質在大腦中負責神經信號傳導的功能相契合，其廣泛的分布有助于在大腦不同區域之間快速傳遞信息。

2.熒光強度變化與大腦功能的潛在關聯
灰質和白質熒光強度隨深度的變化不僅僅是簡單的光學現象，更可能與大腦的生理功能有著緊密的聯系。灰質熒光強度在淺層較高可能意味著該區域神經元活動頻繁，需要更多的能量和物質交換，從而導致較高的熒光信號。而隨著深度增加熒光強度減弱，可能反映出隨著信號傳遞到大腦更深層次，神經元活動方式或物質代謝發生了變化。

白質熒光強度在一定深度增加，可能是由于隨著深度增加，神經纖維束的結構和組成發生改變，影響了熒光物質的分布和激發效率。這些熒光強度的變化為我們理解大腦功能的分區和神經信號傳遞機制提供了新的線索，有助于進一步研究大腦在正常生理狀態以及疾病狀態下的功能變化。

展望未來
一、對神經科學研究的深遠影響
為神經科學研究提供了一個強大的工具和新的視角，有助于我們更深入地理解哺乳動物大腦的微觀結構和神經元作用機制。通過清晰地呈現小鼠大腦灰質和白質的分布以及它們在不同深度的熒光強度變化，我們能夠更準確地構建大腦神經網絡的三維模型，進一步了解神經元之間的連接方式、信息傳遞路徑以及突觸可塑性等關鍵問題，這對于揭示大腦的認知、學習、記憶等高級功能的神經基礎具有重要意義。

在神經疾病研究領域，通過對患病小鼠大腦的成像研究，可以觀察到疾病狀態下大腦微觀結構的異常變化，如灰質萎縮、白質病變等情況，從而深入了解疾病的發病機制。例如，在阿爾茨海默病研究中，我們可以利用該技術追蹤神經元之間的連接受損情況，以及神經遞質傳遞過程中的異常變化，為疾病的早期診斷、藥物研發和治療效果評估提供重要的實驗依據。

二、推動成像技術的進一步發展
對成像系統性能參數的測定以及實驗過程中遇到的問題，為后續成像技術的優化提供了明確的方向。同時，針對成像深度的進一步提升，我們可以研究新型的激光源或光學元件，優化光路設計，減少光在組織中的散射和吸收，從而增加成像深度。此外，提高成像速度也是一個重要的研究方向，這將有助于在活體生物樣品研究中捕捉更快速的生理過程，如神經信號的動態傳遞等。

未來，TPF顯微成像技術有望與其他先進技術進行融合，產生更強大的研究工具。例如，與基因編輯技術相結合，我們可以對特定神經元群體進行標記和功能調控，然后利用TPF顯微成像技術實時觀察這些神經元在生理和病理狀態下的變化，實現對大腦功能的精準解析。與光遺傳學技術融合，可以在對神經元進行光學刺激的同時進行高分辨率成像，研究神經元活動與行為之間的因果關系。

聲明：本文僅用作學術目的。文章來源于：張澤,侯國忠,鄧巖巖,章媛,張德林,李兢兢,王雨雷,呂志偉,夏元欽.小鼠大腦飛秒雙光子熒光三維顯微成像研究[J]. 紅外與激光工程,2023,52(8):20230201.DOI:10.3788/IRLA20230201.