在生物醫學研究領域，對大組織進行高分辨率、快速且精確的成像一直是科學家們追求的目標。傳統的成像技術在面對這一挑戰時，往往存在諸多局限性。共聚焦顯微鏡和雙光子顯微鏡雖然在細胞成像方面表現出色，但在處理大組織成像時，速度慢、光劑量高、穿透深度淺以及分辨率各向異性等問題逐漸凸顯。這些問題使得它們難以滿足對大組織進行全面、細致成像的需求。

近年來，光片顯微鏡（LSM）與組織透明化技術的結合為大組織成像帶來了新的希望。組織透明化技術通過改善組織內部折射率（RI）的不匹配，減少了光的散射，使得光能夠更深入地穿透組織。這一技術突破使得更多實驗室能夠將快速三維成像和組織學研究應用于各種生物樣本，從小鼠、大鼠、兔子到果蠅，甚至人類組織。然而，即使在LSM技術不斷發展的今天，高分辨率成像大組織仍然面臨著諸多挑戰。

在這樣的背景下，一種名為信號改進型超快光片顯微鏡（SIFT）的新型成像技術應運而生，展示了成像平臺在各種透明化組織樣本上的性能，并描述了其在各種透明化方案中的穩健性，為大組織成像研究提供了新的解決方案。

研究內容：SIFT技術的創新設計與原理
1、SIFT的光學設計
雙光片同步掃描：SIFT將傳統遠程聚焦設置分為兩個相同的遠程聚焦臂，通過精確透鏡對組合實現瞳孔匹配，保持光路長度相同，利用透鏡的線性運動范圍實現焦點的亞像素級運動，兩個焦點對稱放置且間距固定，由線性聚焦actuator（LFA）同步移動，通過檢測物鏡成像在相機上，實現了在整個視野（FOV）內的均勻分辨率和高質量同步。

提高成像速度和信號強度：SIFT在特定幀率下，通過雙光片掃描，每個光片覆蓋FOV的一半，使有效曝光時間翻倍，從而提高信號強度。對于熒光信號強的樣本，可在相同檢測光子預算和照明功率下，將幀率提高四倍，且在多種組織成像中表現出色，如小鼠前爪和胃的成像實驗中，成像速度顯著提升。

2、深度學習輔助組織邊界評估
為了進一步提高成像效率，SIFT引入了深度學習（DL）技術。研究人員精心設計了DL分類算法，這一算法就像一位智能的助手，能夠幫助SIFT智能地執行中尺度結構評估任務。可以準確地區分有信息和無信息的圖像塊，就像在一堆雜亂無章的拼圖碎片中，迅速挑選出有用的部分。通過生成組織邊界坐標圖，SIFT能夠精準地定位到組織中真正需要高分辨率成像的區域，避免了對無信息區域的不必要成像，從而大大減少了高分辨率成像的體積。

在實際應用中，這一技術的優勢體現得淋漓盡致。例如，在對復雜形狀的組織進行成像時，傳統方法可能需要對整個組織進行高分辨率掃描，耗費大量的時間和存儲空間。而SIFT結合DL算法，能夠快速篩選出包含組織信息的區域，只對這些關鍵區域進行高分辨率成像，大大提高了成像效率。值得一提的是，這個分類器具有很強的通用性，它與標本類型無關，無論面對何種生物樣本，都能發揮出色的分類作用。這意味著研究人員在研究不同類型的組織時，無需針對新樣本類型進行繁瑣的訓練，就像一把萬能鑰匙，能夠輕松打開各種組織成像的大門。

實驗結果：多維度驗證SIFT的卓越性能
1、顯微鏡性能量化
空間分辨率：為了準確評估SIFT的空間分辨率性能，研究人員采用了一種嚴謹的實驗方法。他們將500nm的熒光珠嵌入2%的瓊脂糖中，制備成實驗樣本。隨后，將瓊脂糖樣本安裝在定制的支架上，并使用線性壓電平臺精確地軸向移動樣本。在成像過程中，SIFT展現出了令人矚目的性能，圖像的分辨率得到了進一步提升。意味著SIFT能夠清晰地分辨出組織內部微小結構的細節，為精準的組織形態學研究提供了有力支持。與傳統的成像技術相比，SIFT在空間分辨率上的優勢使其能夠更準確地揭示組織內部的微觀結構和細胞分布。

時間分辨率：時間分辨率是衡量顯微鏡成像速度的關鍵指標。SIFT在這方面表現出色，其定義為在最大視野（FOV）下獲取一幀圖像所需的時間。實驗結果表明，SIFT能夠在25ms內獲取一幀覆蓋整個FOV的圖像，而傳統的則需要100ms。這一顯著的速度提升得益于SIFT獨特的光學設計，使得兩個焦點能夠同步移動，有效減少了成像過程中的延遲。通過對比可以清晰地看出，SIFT的幀獲取時間相比傳統ASLM提高了四倍。這一速度優勢在實際應用中具有重要意義，特別是在對動態過程進行成像時，SIFT能夠更及時、準確地捕捉到組織內部的變化。

2、多組織成像驗證
小鼠前爪和胃成像：研究人員運用SIFT和傳統ASLM對小鼠前爪和胃進行了成像實驗，以對比兩種技術的性能。在對小鼠前爪的成像中，樣本經過了組織透明化處理，標記了外周神經、相關細胞以及組織的自發熒光信號（用于顯示大體結構，在綠色熒光發射通道成像）。SIFT在成像速度上展現出了巨大的優勢，對于雙色清除小鼠前爪，SIFT的總幀獲取時間僅為4.93小時，而傳統ASLM則需要長達19.73小時。在對小鼠胃的成像實驗中，同樣使用了SIFT和傳統ASLM進行對比。SIFT在成像過程中，通過深度學習（DL）算法，從5054個低分辨率圖像塊中篩選出了2171個包含組織信息的圖像塊進行高分辨率成像。SIFT的總幀獲取時間為6.40小時，而傳統ASLM則需要25.63小時。

多透明成像：SIFT的多透明物鏡是其另一大亮點，使其能夠對組織透明化處理并浸于不同折射率介質中的樣本進行成像。在對斑馬魚幼蟲的成像實驗中，研究人員選擇了3天受精后的斑馬魚幼蟲，將其麻醉后嵌入1.5%瓊脂糖中，并安裝在氟乙烯丙烯（FEP）管中（其折射率與水匹配）。SIFT能夠清晰地觀察到斑馬魚幼蟲在尾損傷后的炎癥反應，以及穩態條件下細胞在整個幼蟲體內的發育變化。在對小鼠結腸的成像中，經過整體組織透明技術處理，并進行免疫染色。SIFT的各向同性分辨率使得研究人員能夠清晰地觀察到結腸組織中神經元的樹突和突起，以及神經元之間的連接。在對小鼠腦的成像實驗中，分別使用了整體組織透明小鼠腦。SIFT能夠對大腦進行高分辨率成像，清晰地顯示出神經元的活動和細胞結構，為神經科學研究提供了有力的工具。

研究結論：SIFT推動大組織成像技術邁向新高度
這一創新技術通過獨特的雙焦點成像方案和深度學習分類網絡,顯著提升了大組織成像的速度和效率。在多種樣本成像實驗中，SIFT均表現出卓越的性能，無論是小鼠前爪、胃，還是斑馬魚幼蟲、小鼠結腸和大腦等組織，SIFT都能以更快的速度獲取高質量的圖像。其在空間分辨率和時間分辨率方面的優勢，使得研究人員能夠更清晰地觀察組織內部結構，更及時地捕捉動態變化。

SIFT對不同組織透明化方法適應性強，在生物醫學成像領域應用潛力大。雖目前成像速度受相機等限制，但為ASLM技術發展提供重要思路。未來，靠改進相機、采用更快LFA或優化控制信號等，有望提升其性能，為生物醫學研究開拓更多可能，助力探索生命奧秘、攻克疾病難題。

聲明：本文僅用作學術目的。文章來源于：Prince, M.N.H., Garcia, B., Henn, C. et al. Signal improved ultra-fast light-sheet microscope for large tissue imaging. Commun Eng 3, 59 (2024). https://doi.org/10.1038/s44172-024-00205-4.