隨著納米技術的發展，納米顆粒（NPs）已廣泛應用于多個領域，但其對人體健康的長期影響仍不明確。近期研究利用CERO 3D細胞類器官培養系統等創新技術，深入探究了納米顆粒對細胞的長期影響。

研究背景與意義
傳統細胞毒性測試多關注短期暴露，難以評估納米顆粒長期接觸細胞的潛在風險。CERO 3D系統為研究提供了新工具，有助于理解納米顆粒與細胞的相互作用，為納米材料的安全應用提供理論支持。

實驗方法和結果
細胞毒性測定
研究選擇了EAhy 926內皮細胞和THP-1單核細胞，使用CASY系統精確控制細胞數量。內皮細胞采用CERO 3D培養和傳統傳代培養，單核細胞在CELLine CL350生物反應器中培養（圖1）。實驗選用了多種納米顆粒，通過先進技術全面表征其物理化學性質，并使用熒光標記的納米顆粒精確測定細胞攝取率。細胞毒性測定采用CellTiter 96® AQueous非放射性細胞增殖測定法（基于甲臜生物還原原理），能夠精準評估納米顆粒對細胞增殖的影響。
 

圖1：暴露方案：A：在臺式生物反應器BioLevitator中微珠上培養細胞。B：在CELLine 350燒瓶生物反應器中培養細胞。C：當對照細胞達到融合度時將所有細胞轉移到更大的培養容器中（C1），或者在新的相同大小的培養容器中以1:10的比例收獲并傳代細胞（C2）。

選擇暴露系統對細胞毒性測試結果至關重要，不是所有系統都同樣有效。CELLine CL350系統不適合評估THP-1細胞的慢性細胞毒性，因為它對細胞密度敏感。在細胞毒性測試中，需要避免高細胞密度以防止生長抑制。在CELLine CL350系統中，只有低細胞密度條件下才能進行長達16天的觀察，但細胞生長不可重復。傳代實驗中，直接轉移所有細胞的方法（圖1C1）比每周1:10傳代的方法更可靠（圖1C2）。長期細胞毒性的濃度通常是急性細胞毒性濃度的一半，不同納米顆粒的長期和短期暴露毒性濃度差異顯著。

針對不同細胞類型和培養系統，研究人員精心設置了合理的暴露濃度范圍，如聚苯乙烯顆粒為12.5 - 25 - 50 μg/ml，二氧化硅顆粒為25 - 50 - 100 μg/ml，SCNTs為5 - 10 - 20 μg/ml。同時，確定了不同培養條件下的最長評估時間，在CERO 3D 細胞類器官培養系統中培養的EAhy926 細胞最長評估時間可達28天，在CELLine CL350 中培養的THP - 1細胞為16天，傳代培養的EAhy926細胞和THP - 1細胞為16天，為全面評估納米顆粒的短期和長期細胞毒性提供了可靠依據。

納米顆粒性質變化與細胞攝取
結果顯示，納米顆粒在培養基中行為復雜，團聚現象明顯，部分積累在細胞溶酶體中。細胞對納米顆粒的攝取率因類型而異，攝取率與細胞毒性之間無簡單線性關系。

圖2：EAhy926細胞在暴露于紅色熒光標記的納米顆粒PPS20（A）、SiO2（B）和SCNTc（C）24小時后的攝取情況。顆粒（紅色）與溶酶體（通過綠色熒光活性染料LysoTracker識別）在不同程度上共定位。共定位顯示為黃色。比例尺：20微米。

所有納米顆粒均出現了不同程度的團聚，羧基化單壁碳納米管迅速聚集成束，單管比例微乎其微；聚苯乙烯顆粒和二氧化硅顆粒的尺寸在培養基中顯著增大。與此同時，納米顆粒部分積累在細胞溶酶體中，細胞對納米顆粒的攝取率因細胞類型而異，EAhy926 細胞攝取率約為2%，THP-1細胞約為7%。

研究微載體培養中納米顆粒的作用模式與長期效應
CERO的這個載體培養系統（70小時）比常規培養（30小時）更有效。EAhy 926細胞在GEM™表面上增殖，并通過Hoechst 33342、線粒體和內質網活性染色顯示細胞活力，同時紅色熒光PPS主要在溶酶體中定位。
 

圖3：在優化微載體培養系統中加入無毒濃度的20 nm和200 nm PPS及MWCNT納米顆粒，每周更新培養基。采用Hoechst 33342染色觀察細胞附著（3 A），用ER-Tracker green和MitoTracker DeepRed 633標記細胞器評估細胞活力(3 B)，并用紅色熒光PPS追蹤納米顆粒定位（主要至溶酶體）(3 C)。每周通過ApoTox-Glo Triplex Assay評估細胞活力、毒性和凋亡情況，7天后行Western blot分析PARP-1以區分凋亡與壞死，深入探究納米顆粒在微載體培養中的作用及長期影響機制。

EAhy 926細胞附著在GEM™上。用Hoechst 33342染料染色顯示了在GEM™上的細胞增殖增加（圖3 A）。此外，對線粒體和內質網（ER）的活性染色證明了細胞的活力（圖3 B）。細胞內PPS的定位：細胞暴露于20 mg/ml的紅色熒光PPS以研究細胞定位。在細胞內觀察到R25，主要定位在溶酶體中（圖3 C）。

CERO系統的優勢
CERO 3D細胞類器官培養系統在細胞毒性檢測中具有顯著優勢，其3D培養技術模擬體內環境，自動化操作簡化了實驗流程，同時高精度監測與控制功能、低剪切力設計和高效氣體傳遞能力共同為細胞提供了適宜的生長環境，維持了細胞的完整性和生理功能。此外，系統的可擴展性為從實驗室規模到大規模藥物研發生產的不同規模研究提供了便利，提高了實驗效率和可重復性，是研究納米顆粒長期影響的理想模型。

展望
研究結果表明，長期暴露于納米顆粒對細胞有顯著影響，檢測細胞毒性的濃度與暴露模型緊密相關，為安全應用奠定理論基礎并指明研究方向。未來，優化CERO系統培養條件，深入探究納米-細胞器互作，開發更靈敏檢測法，將全面理解納米顆粒對細胞的影響。CERO等技術助力納米技術在醫療、食品等領域發揮更大潛力，造福人類健康與社會發展。