導語
胰腺癌是導致癌癥死亡的主要疾病之一，且預計到2040年將成為第二大死因。盡管治療手段有所進步，但胰腺癌的五年生存率仍然很低，因為大多數患者在診斷時已處于晚期。因此，需要深入了解胰腺癌的生物學特性以改善治療效果。本研究通過單細胞RNA測序（scRNA-seq）和空間轉錄組測序（ST -seq)分析胰腺癌組織，以揭示腫瘤微環境中的異質性。對17名胰腺腫瘤患者樣本進行了深度測序。分析揭示了胰腺癌腫瘤微環境中的異質性，并發現了一個新的癌細胞亞群Ep_VGLL1，它具有介于經典型和基底樣亞型之間的中間特征，可能代表了胰腺癌進展中的一個過渡狀態。這一發現為胰腺癌的治療提供了新的視角和潛在的治療靶點。

主要技術
scRNA-seq、ST -seq

研究結果
1. 胰腺癌細胞和CAF的全面單細胞轉錄組圖
為了解釋癌細胞和CAF的異質性，研究人員對17名胰腺腫瘤患者（包括16名胰腺癌患者和1名帶有高級別異型增生的胰腺導管內乳頭狀粘液性腫瘤，IPMN）的手術樣本進行單細胞RNA測序，富集了CD45陰性細胞（圖1A）。鑒定出了五種主要的細胞類型：上皮細胞、成纖維細胞、血旺細胞、內皮細胞和星狀細胞（圖1B）。隨后，研究人員使用拷貝數變異推斷工具來識別癌癥細胞，并發現預測的惡性細胞位于上皮細胞群體中（圖1C）。進一步對上皮細胞和成纖維細胞進行了亞群聚類，以便進一步進行特征描述。胰腺癌上皮細胞通過每個群特異性的marker基因注釋成9個簇（圖 1D）。研究人員特別關注KRAS基因G12位點的突變狀態，發現Ep_FXYD2亞群中的細胞大多含有野生型KRAS序列，暗示這些細胞可能代表非癌性上皮細胞，是癌前導管樣細胞。研究還識別出Ep_CDK1亞群為增殖的癌上皮細胞，具有明顯的細胞周期標志物（圖1D）。最終，分析確定了不包括癌前Ep_FXYD2亞群和循環Ep_CDK1亞群共六種癌細胞亞群，這些亞群在增殖上表現出差異，其中Ep_TRIM54、Ep_KRT6A和Ep_VGLL1在循環細胞群體中富集，表明它們相對更具增殖性（圖1E）。同樣對成纖維細胞進行聚類分析，得到了八個成纖維細胞亞群（圖1F）。排除Fb_Base和Fb_CDK1亞群，確定了六個具有獨特基因表達特征的胰腺癌相關成纖維細胞（CAF）亞群，包括三個已被充分描述的CAF群體：Fb_SFRP1（炎癥性CAF，iCAF）、Fb_LRRC15（肌成纖維細胞性CAF，myCAF）和Fb_MSLN（抗原呈遞CAF，apCAF）。
 

圖 1

2. 基于群體的聚類揭示了胰腺癌的病理和分子亞型。
在確定了胰腺癌組織中癌細胞和CAF詳細亞群后，接下來想知道是否可以根據這些單細胞群的組成對患者進行分層。研究發現，基于癌細胞和CAF亞群組成的不同，可以將患者分為三個明顯的群，即hClust0-2。其中，hClust0群中富含IPMN相關的樣本，而hClust1和hClust2群中晚期疾病狀態的患者更為集中。每個患者群都與特定的癌細胞亞群顯著相關：hClust0與Ep_MSMB亞群相關，hClust1與Ep_TRIM54亞群相關，而hClust2與Ep_KRT6A和Ep_VGLL1亞群相關。此外，還發現hClust0群的CAF亞群多樣性較低，主要由Fb_COL9A1亞群主導。這些發現通過層次聚類分析（圖2B、C）和臨床數據對比得到了驗證（圖2D、E）。每個患者群都可以通過特定癌細胞亞群的顯著富集來標記（圖 2F）。并且通過比較與胰腺癌亞型相關的基因表達特征進一步表征了患者群體（圖2G）。同時，也觀察到hClust0群體中CAF亞群的特定分布，多樣性低于其他的患者群（圖2H、I）。
 

圖 2

3. Ep_VGLL1：一種與不良預后相關的新型胰腺癌細胞群
接下來，使用公共數據評估癌癥和CAF簇的預后價值。在所有上皮細胞和成纖維細胞亞群中，只有Ep_KRT6A和Ep_VGLL1的標志物具有預后意義，它們表示不良預后（圖3A、B）。高Ep_KRT6A組的不良預后是可預測的，因為它具有基底樣特征，與Ep_VGLL1組不同，Ep_VGLL1組沒有顯示任何先前定義的特征（圖2G）。通路富集分析清楚地表明，與Ep_VGLL1相比，Ep_KRT6A表達更高水平的上皮-間充質轉化（EMT）基因集（圖3C）。此外，Ep_KRT6A評分與整個癌細胞的EMT評分呈明顯正相關，與Ep_VGLL1評分無相關性（圖3D）。最重要的是，PDAC組織的RNA原位雜交圖像清楚地分離了表達VGLL1的細胞和表達KRT6B的細胞（圖3E）。
 

圖 3

4. 解讀調控胰腺癌細胞簇的轉錄因子網絡
為明確癌細胞簇的生物學特性，通過SCENIC分析各亞群中轉錄因子（TF）活性（圖4A）。值得注意的是，推斷出的TF活性被分為不同的群，這些群與上皮亞群有很好的相關性。接著，基于TF活性數據重建相關性TF網絡（圖4B），依上皮細胞群特性命名各組TF：Ep_MSMB對應“IPMN-associated”；Ep_TRIM54含高活性“classical”TF，Ep_KRT6A等含“basal-like”TF，二者對比鮮明；“EMT-related”TF群含關鍵調控因子，對Ep_KRT6A有高度特異性；還識別出Ep_VGLL1特異性TF，處于關鍵連接位置。最后，TF活性的擴散圖與PCA投影顯示，Ep_VGLL1對應的TF群位于“classical”和“basal-like”群中點，由此推測Ep_VGLL1代表過渡癌細胞群體，其特異性TF標注為“transitional”（圖4C）。
 

圖 4

5. Ep_VGLL1的分子特征表明其具有過渡特性
通過TF分析發現，Ep_VGLL1呈現出獨特的SOX4與KLF5活性水平（圖 5A）。進一步觀察發現，Ep_VGLL1中SMAD4 平均表達量處于低位，與基底樣群相當，這暗示它具備基底樣特性；同時，該群中經典胰腺癌替代標志物GATA6表達量低，體現出其非經典性質，且已知GATA6與Wnt信號通路依賴相關，低表達也意味著 Ep_VGLL1 具有Wnt獨立性（圖 5B）。細胞間通訊分析結果顯示，Ep_VGLL1 能夠作為信號發送者參與 Wnt 信號通路（圖 5C），利用過往報道的 Wnt 依賴基因特征進行分析，發現Ep_VGLL1 和其他基底樣簇一樣，有著明顯的 Wnt 獨立特征（圖 5D）。由于KLF5 是維持多種細胞類型上皮細胞特性的關鍵要素，對Ep_VGLL1細胞身份的探究發現，它高表達緊密連接蛋白基因TJP1與OCLN，而間充質細胞標記物VIM、S100A4表達量低，這有別于其他基底樣簇，表明其仍保留上皮細胞特性（圖 5E）。近期有報道稱，在FOLFIRINOX治療下，胰腺癌腫瘤球體細胞會通過癌內在機制發生從經典型到基底樣的轉變。利用自身的亞群標志物追蹤這一轉變過程，結果顯示Ep_TRIM54特征隨時間逐漸減少，Ep_KRT6A 特征不斷增加，而Ep_VGLL1特征在第4天達到峰值，隨后逐漸下降，恰好位于Ep_KRT6A 激增之前（圖 5F）。綜合來看，這些結果揭示出Ep_VGLL1 群處于中間過渡狀態，很可能代表著基底樣與經典型癌細胞之間的過渡群體。
 

圖 5

6. 空間轉錄組數據揭示人類胰腺癌中癌癥亞群和相關微環境的動態
研究人員利用癌細胞和CAF亞群的詳細參考圖譜來探究人類胰腺癌的空間復雜性。從scRNA-seq隊列中生成了7對空間轉錄組數據，并使用貝葉斯推斷模型對這些數據進行分析，以識別不同細胞類型和亞群的空間分布模式（圖6A）。隨后，比較了scRNA數據和配對空間轉錄組數據中癌細胞和成纖維細胞亞群 (圖6B-C) 的組成。結果發現，空間轉錄組數據中的癌細胞亞群組成與單細胞數據中的癌細胞組成高度一致 (圖 6D)，而成纖維細胞組成則不同 (圖6E-F)。
 

圖 6

7. 胰腺癌中癌細胞亞群與腫瘤微環境的空間關聯性研究
在這項研究中，研究人員還關注胰腺癌中基質細胞和免疫細胞的分布以及它們與癌細胞亞群的空間相關性。通過鄰接網絡圖，區分了靠近和不靠近癌細胞的細胞類型（圖7A-C）。還發現，肌成纖維細胞CAF群的代表Fb_LRRC15在空間分布上與胰腺癌細胞高度相關（圖7D），而炎癥成纖維細胞iCAF的代表Fb_SFRP1則位于遠離癌癥區域的位置（圖7E）。值得注意的是，主要的癌細胞亞群Ep_TRIM54、Ep_VGLL1和Ep_KRT6A均未顯示出對Fb_LRRC15的偏好（圖7D）。這一點與單細胞RNA測序數據一致，即這些癌細胞亞群單獨與Fb_LRRC15無相關性，但它們的總和與Fb_LRRC15的比例高度相關（圖7F）。
 

圖 7

結論
本研究通過單細胞轉錄組和空間轉錄組，對胰腺癌腫瘤微環境中的上皮細胞和成纖維細胞進行了全面分析。鑒定了五種不同的功能性胰腺癌細胞亞群和六種不同的癌相關成纖維細胞亞群。在這些亞群中，識別了一個新型的癌細胞亞群Ep_VGLL1，它顯示出介于基底樣和經典亞型之間的中間特征，這一點得到了空間轉錄組數據的支持。這種綜合性分析不僅提供了胰腺癌和成纖維細胞群體的全面景觀，還為胰腺癌細胞的動態狀態提供了新的見解，并揭示了潛在的治療靶點。

參考文獻：
Kim S, Leem G, Choi J, et al. Integrative analysis of spatial and single-cell transcriptome data from human pancreatic cancer reveals an intermediate cancer cell population associated with poor prognosis. Genome Med. 2024 Jan 31;16(1):20. doi: 10.1186/s13073-024-01287-7. PMID: 38297291; PMCID: PMC10832111.