導讀
在轉移性乳腺癌（MBC）患者的臨床管理中，精確評估腫瘤的分子特征至關重要，尤其是在預測治療反應和監測耐藥性方面。ERBB2（或HER2）基因的擴增或突變在乳腺癌的發病機制中起著重要作用，約20%的乳腺癌患者具有ERBB2的過表達或擴增。這類患者通常表現出較為侵襲性的疾病，并且對抗HER2的靶向治療（如曲妥珠單抗、帕妥珠單抗）具有良好的反應。然而，隨著治療的進行，部分患者可能會出現耐藥性，尤其是在疾病轉移階段，HER2的基因突變或擴增狀態可能發生變化，導致療效下降。

傳統ERBB2的檢測方法主要包括免疫組化、熒光原位雜交和基因擴增分析（如PCR）。這些方法通常基于腫瘤組織樣本，但在轉移性乳腺癌中，獲取可用于檢測的組織樣本往往較為困難，且侵入性較大。與此同時，腫瘤的異質性也可能導致在不同病灶間ERBB2狀態的差異，從而影響檢測結果的可靠性。

法國雷恩尤金馬奎斯中心在Molecular Oncology發表了題為"Plasma-based analysis of ERBB2 mutational status by multiplex digital PCR in a large series of patients with metastatic breast cancer "的文章。該研究聚焦于利用數字PCR技術檢測轉移性乳腺癌患者血漿中的ERBB2基因突變狀態。作者探討了通過血漿中的cfDNA檢測ERBB2突變狀態，作為一種非侵入性且可靠的檢測方法的可能性。

 應用亮點：
• 通過多重數字PCR（mdPCR）技術分析血漿樣本中的ERBB2突變狀態，能夠高精度地檢測到低頻突變，在cfDNA檢測中且具有非常高的靈敏度和特異性。

• 通過大量患者樣本檢測，展示了該技術在不同臨床背景下廣泛適用性和穩定性，提高了研究結果的可靠性。

 實驗結果：
1、多重篩查檢測方案的設計和優化
研究者設計開發了一個ERBB2 (S) assay，能夠單孔檢測17種不同的ERBB2突變，方案見下圖：

(A)ERBB2(S) assay的設計,使用四對引物（灰色箭頭）同時擴增四個片段。FAM標記探針（藍色）檢測S310F和S310Y突變；HEX標記探針（綠色）檢測D765S、D769H、D769Y、Y772_A775dup、G778_P780dup和L869R突變；FAM標記的降落探針（藍色）+ Cy5標記的參考探針（紅色）檢測776-779位點的突變。

(B) 三色檢測策略在772-780擴增子上的不同擴增情況。野生型序列：drop-off探針和參考探針都檢測到，產生FAM+Cy5雙陽性信號（case1）。776-779位點突變：僅檢測到參考探針，產生Cy5單陽性信號（case2）。772_A775dup或G778_P780dup突變: HEX探針和參考探針都檢測到，產生HEX+Cy5雙陽性信號（case3）。Y772_A775dup突變（case4）、G778_P780dup突變（case5）或兩者同時存在（case6）會產生FAM+HEX+Cy5+三陽性信號。

該方案中研究者通過不同的熒光信號組合來識別特定的ERBB2突變，為臨床提供精確的基因突變信息。這種多重檢測方法的優勢在于能夠在同一反應中檢測多種突變，提升檢測效率并降低成本。

2、ERBB2 (S) 檢測的優化及驗證

每個熒光通道陰陽性微滴的熒光閾值設置如下圖所示。設置閾值時，應將陽性和陰性對照的點圖與樣本的點圖一起合并分析。確保在閾值設置后，陽性對照中的陽性微滴可以被正確統計。

使用系列稀釋的MUT gBlocks (設計合成特定的ERBB2基因突變位點，作為數字PCR檢測方法的陽性對照)在恒定的WT gDNA背景中進行敏感性測試，結果表明檢測的敏感性分別為S310F/Y為0.25%，L755S-D769H/Y-L869R為0.27%，Y772_A775dup-G778_P780dup為0.18%，776-779MUT為0.10%。

(A)ERBB2(S)Assay：1D圖(左)：顯示了每個探針在單重反應中產生的優化熒光信號。2D圖(中)：展示了通過混合野生型gDNA和突變gBlocks定義的多邊形閾值策略。3D圖(右)：根據相對的FAM-HEX-Cy5熒光信號顯示簇的位置。
(B)六種野生型-突變雙重檢測定義的多邊形閾值的策略。

線性研究驗證了在5到1000 copies/PCR動態范圍內的準確性，線性回歸分析的R²值在0.9948到0.9999之間。

研究還評估了檢測的重復性和再現性，CV值在3.4%到12.5%之間，滿足數字PCR驗證實驗中CV值小于20%的接受標準。

3、ERBB2突變的診斷策略
研究者開發了一個臨床兩步診斷策略（見下圖）：首先進行初步的篩查，如果結果為陽性（即發現ERBB2基因的突變），則進行第二步的WT-MUT Duplex檢測以精確識別突變類型。

4、患者樣本的ERBB2突變檢測結果
在272名HR+/HER2MBC患者的304份血漿樣本中，有9名患者（3.3%）至少攜帶一種ERBB2突變。突變樣本的cfDNA濃度和突變等位基因頻率（MAF）在不同患者中分布廣泛。

在9名突變患者中，有3名患者同時檢測到兩種ERBB2突變，這可能是由于檢測的高靈敏度，能夠檢測到低至0.06%的低頻突變。對其中兩名患者進行了ERBB2突變水平的縱向隨訪，發現突變濃度的變化與疾病進展和治療反應相關。

在6名患者的匹配腫瘤樣本中，有5名患者的ERBB2突變在血漿cfDNA和腫瘤組織之間具有一致性。

結論：
多重數字PCR技術可以有效地檢測ERBB2突變狀態，并在晚期轉移性乳腺癌患者中具有潛在的臨床應用價值。通過血漿樣本檢測ERBB2突變，不僅提供了對腫瘤基因組狀態的實時監測，而且能夠為個體化治療提供重要信息，為患者靶向治療的決策提供依據。數字PCR用于非侵入性檢測方法的開發平臺，有望成為未來乳腺癌分子診斷和監測的重要工具。

參考文獻：
Corné J, Quillien V, Godey F, et al. Plasma-based analysis of ERBB2 mutational status by multiplex digital PCR in a large series of patients with metastatic breast cancer. Mol Oncol. 2024; ahead of print. doi:10.1002/1878-0261.13592.

實體瘤突變檢測可用于患者全病程管理（基因分型、靶向藥檢測、療效和預后評估、復發監測），艾普拜生物已開發測試針對多種樣本類型（體液、新鮮冰凍組織、FFPE）的常見突變數字PCR檢測試劑盒，詳情見下表。