單細胞轉錄組測序揭示錳離子在腫瘤NK細胞功能調控中的角色
期刊：MedComm
伯豪技術服務產品：單細胞轉錄組測序、伯優®單細胞測序組織/細胞保存液
導語
研究背景：NK細胞在固有免疫和適應性免疫中均有重要的作用，Mn2+激活cGAS-STING通路，但該機制對NK細胞的影響尚不明確。
科學問題：Mn2+如何調控NK細胞的激活。
實驗材料：C57BL/6小鼠、NK-92MI細胞系、人類和小鼠的原代NK細胞。
表型：Mn2+處理顯著抑制小鼠黑色素瘤生長，且NK細胞在這一過程中受到Mn2+調控。
機制：Mn2+激活NK細胞中的cGAS-STING通路，激活UTX的表達，提升NK細胞的響應，直接增強NK細胞的細胞毒性和細胞因子分泌，并通過NK細胞間接激活CD8+ T細胞。
主要技術
單細胞轉錄組測序（技術服務由伯豪生物提供）
研究結果
1. Mn2+的抗腫瘤效應依賴于NK細胞
作者通過向C57BL/6小鼠中注射小鼠黑色素瘤細胞B16F10，構建腫瘤模型，分四次腹腔注射MnCl2，觀察到Mn2+處理顯著抑制腫瘤生長，NK細胞、CD8+T細胞等均有顯著增加，NK細胞具有更強的抗腫瘤活性（Fig. 1A-D, S1A, B）。
為了探究Mn2+抗癌的主要影響因素，作者設計了Rag1全身性敲除（Rag1-/-）的免疫缺陷性小鼠，阻斷T細胞和B細胞的發育和分化。在排除了T細胞和B細胞的影響后，Mn2+的抗腫瘤能力依舊顯著強于對照組，另一方面，Mn2+處理組中的NK細胞的激活水平也顯著高于對照組（Fig. 1F, G）。在使用NK細胞抑制劑處理后，腫瘤生長顯著上調，而Mn2+的抗腫瘤效應下調（Fig. 1H, I, J）。回補Mn2+，有部分CD8+ T細胞受到激活，腫瘤的生長因此受到部分抑制（Fig. 1I, J, K）。如上結果暗示了NK細胞在Mn2+介導的抗腫瘤效應中發揮的關鍵性作用，以及Mn2+在此過程中還可能通過NK依賴或非依賴的方式激活其他類型的免疫細胞。
Fig. 1. NK細胞調控Mn2+的抗腫瘤效應
2. Mn2+直接調控NK細胞的細胞毒性
考慮到NK細胞在清除腫瘤細胞過程中發揮的重要作用，作者選擇小鼠胰腺和人類PBMC中分離純化出來的NK細胞，用于探究Mn2+對NK細胞的細胞毒性的調控。結果表明，Mn2+處理不會對NK細胞的生長和凋亡產生顯著性的影響，但能使得NK細胞激活marker的表達水平上調（Fig. 2A-F）。
隨后，作者選取NK-92MI細胞系和人類原代NK細胞，與靶細胞K562分別以不同的細胞比例（E:T）進行共培養48小時，可見兩種NK細胞的Mn2+處理組的細胞毒性均有顯著上調，鼠源NK細胞和靶細胞同理可證，即Mn2+提高NK細胞的腫瘤殺傷性（Fig. 3A-H）。
Fig. 2. Mn2+增強NK細胞的激活水平
Fig. 3. Mn2+直接增強NK細胞對腫瘤的細胞毒性
3. Mn2+通過NK細胞增強CD8+ T細胞的激活
前文提到，Mn2+的抗腫瘤效應除了可能依賴于對NK細胞細胞毒性的直接調控外，還可能通過NK細胞進一步調控T細胞。為了驗證這種可能性，作者檢測了NK細胞去除的小鼠中CD8+ T細胞的激活水平，發現Mn2+處理可以讓CD8+ T細胞激活水平顯著上調但低于對照組（Fig. 1K）。作者分析了CD45+ 腫瘤浸潤細胞的單細胞轉錄組測序（scRNA-seq；測序服務由伯豪生物提供）數據，發現Mn2+處理組中NK細胞、CD8+ T細胞及其他一些細胞類型在數目和比例上顯著增加，GO和KEGG富集到了NK細胞中趨化因子和白細胞遷移等與表型和功能相關通路的顯著激活，隨后用體外實驗驗證了趨化因子濃度在Mn2+處理條件下的變化（Fig. 4A-F）。在Mn2+處理條件下，CD8+ T細胞和NK細胞共培養時，其激活水平和細胞毒性相比于無Mn2+組均有進一步的顯著提升（Fig. 4G-L）。綜上，作者得到結論：Mn2+處理可以通過NK細胞依賴或非依賴的方式調控CD8+ T細胞。
Fig. 4. Mn2+通過NK細胞激活CD8+ T細胞
4. Mn2+通過cGAS-STING-UTX途徑激活NK細胞
cGAS-STING途徑在以往的研究中已經被報道受到Mn2+調控[1][2][3]，UTX也被報道在NK細胞響應中具有重要的作用[4]，而本研究中關于Mn2+調控NK細胞的結果也就成為了連接上述兩個結論的關鍵。
首先，作者在STING全身性敲除的小鼠（STING-/-）中驗證了NK細胞的增殖和凋亡都不受Mn2+調控，且完全不會被Mn2+處理激活；其次，作者在野生型小鼠中分別利用cGAS和STING的抑制劑對cGAS-STING信號通路進行抑制，觀察到Mn2+處理不會影響NK細胞的增殖，但NK細胞的激活水平不再受Mn2+處理的顯著上調（Fig. 5）。
最后，為了驗證UTX在Mn2+依賴的NK細胞激活調控機制中發揮的作用，作者在scRNA-seq結果中通過在轉錄水平上計算cGAS和STING的表達水平與UTX表達水平之間的相關系數，推斷出cGAS-STING通路與UTX具有顯著的相關性，并使用TCGA數據庫中的公共數據對這一結論進行了驗證，隨后進一步通過公共數據發現了UTX轉錄水平和NK細胞豐度之間具有顯著的正相關性（Fig. 6A, B）。
Mn2+處理能在轉錄和翻譯水平上調UTX，但這種調控在STING敲除的NK細胞中受到明顯的抑制（Fig. 6C, D）。在cGAS或STING抑制劑處理的NK細胞中過表UTX可以顯著回補激活的NK細胞占比，反之亦然（Fig. 6E-H）。
綜上，作者驗證了Mn2+依賴的cGAS-STING-UTX通路調控NK細胞激活的機制。
Fig. 5. Mn2+通過NK細胞固有的cGAS-STING途徑激活NK細胞
Fig. 6. Mn2+通過STING誘導UTX表達進而激活NK細胞
參考文獻：
[1]. Hooy RM, Massaccesi G, Rousseau KE, Chattergoon MA, Sohn J. Allosteric coupling between Mn2+ and dsDNA controls the catalytic efficiency and fidelity of cGAS. Nucleic Acids Res. 2020;48(8):4435-4447.
[2]. Wang C, Guan Y, Lv M, et al. Manganese increases the sensitivity of the cGAS-STING pathway for double-stranded DNA and is required for the host defense against DNA viruses. Immunity. 2018;48(4).
[3]. Zhao Z, Ma Z, Wang B, Guan Y, Su X-D, Jiang Z. Mn2+ directly activates cGAS and structural analysis suggests Mn2+ induces a noncanonical catalytic synthesis of 2’3’-cGAMP. Cell Rep. 2020;32(7):108053.
[4]. Cheng MI, Li JH, Riggan L, et al. The X-linked epigenetic regulator UTX controls NK cell-intrinsic sex differences. Nat Immunol. 2023;24(5):780-791.
