在胚胎發(fā)育過程的研究中，胚胎各階段的形態(tài)特征是評(píng)價(jià)其發(fā)育優(yōu)劣的重要依據(jù)，用于指導(dǎo)胚胎體外培養(yǎng)體系的優(yōu)化和改進(jìn)。但若使用傳統(tǒng)形態(tài)評(píng)估方法檢測(cè)胚胎發(fā)育，可能會(huì)忽略胚胎的關(guān)鍵階段，特別是胚胎分裂和異常的合子卵裂模式。

圖1 胚胎發(fā)育的簡(jiǎn)要過程

目前，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)評(píng)分是最常用的胚胎評(píng)估方法，但是需要將胚胎反復(fù)取出培養(yǎng)箱只能觀測(cè)胚胎發(fā)育的某些時(shí)間點(diǎn)，而通過活細(xì)胞成像技術(shù)可以對(duì)胚胎進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，獲得胚胎連續(xù)動(dòng)態(tài)發(fā)育圖譜，觀測(cè)胚胎發(fā)育過程中的異常發(fā)育行為。

 
活細(xì)胞成像技術(shù)如何支持胚胎發(fā)育研究？

①長(zhǎng)時(shí)間實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)

胚胎發(fā)育是一個(gè)長(zhǎng)期復(fù)雜的過程。活細(xì)胞成像能夠進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)數(shù)天甚至數(shù)周的無中斷觀測(cè)，記錄從早期胚胎到分化形成階段的整個(gè)過程。
 

②無損傷觀察

傳統(tǒng)的顯微成像方法可能需要頻繁操作胚胎，導(dǎo)致其受損甚至無法繼續(xù)發(fā)育。活細(xì)胞成像采用溫和的成像技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)無標(biāo)記觀察，保證培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定。
 

③優(yōu)化胚胎選擇

活細(xì)胞成像能夠觀察與評(píng)估卵母細(xì)胞植入前胚胎發(fā)育，優(yōu)化胚胎選擇；提供胚胎發(fā)育中的關(guān)鍵形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如：卵裂時(shí)間間隔、卵裂方式等。
 
延時(shí)成像技術(shù)在胚胎發(fā)育研究中的應(yīng)用
 
在胚胎發(fā)育的研究中，卵母細(xì)胞同樣是一個(gè)非常關(guān)鍵的研究對(duì)象。卵母細(xì)胞的質(zhì)量（如遺傳缺陷、細(xì)胞質(zhì)組成等）決定了其能否成功完成受精并支持胚胎細(xì)胞的早期發(fā)育。卵母細(xì)胞的基因表達(dá)也在其發(fā)育的早期階段起著重要作用，卵母細(xì)胞內(nèi)的RNA和蛋白質(zhì)提供了起始的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。也因此，卵母細(xì)胞常作為胚胎發(fā)育的研究起點(diǎn)。
 
2022年10月，Cell Proliferation 發(fā)表了題為《Peripubertal requirement of Tsg101 in maintaining the integrity of membranousstructures in mouse oocytes》展示了通過延時(shí)成像技術(shù)監(jiān)測(cè)小鼠卵母細(xì)胞形態(tài)變化，后通過免疫熒光染色、q-PCR、透射電鏡等研究在Tsg101缺失的情況下導(dǎo)致卵母細(xì)胞死亡的原因。
 

圖2、3 研究人員從 Tsg101f/f 和 Tsg101d/d 小鼠身上收集了 GV（原期 I）階段的卵母細(xì)胞并在體外使用JuLI Stage 活細(xì)胞成像儀延時(shí)記錄，間隔1h拍攝一輪，共拍攝12h。

 

結(jié)果表明：21-27 天的青春期前小鼠（I 組）和 28 天以上的青春期前小鼠的表型明顯不同。Ⅰ組 Tsg101d/d 小鼠約 10% 的卵母細(xì)胞出現(xiàn)異常，而Ⅱ組 Tsg101d/d 小鼠高達(dá) 80% 的卵母細(xì)胞在 12 h 前退化或萎縮。延時(shí)顯微鏡圖像顯示，Ⅱ組 Tsg101d/d 小鼠的 GV 卵母細(xì)胞在培養(yǎng)的最初幾個(gè)小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)萎縮和破裂。II組Tsg101d/d小鼠卵母細(xì)胞死亡時(shí)伴有明顯的PM破裂。
 
該研究利用延時(shí)成像技術(shù)監(jiān)測(cè)正常與基因缺失的胚小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育，監(jiān)測(cè)其形態(tài)變化以及動(dòng)態(tài)表達(dá)，以探索基因缺失與細(xì)胞死亡的關(guān)聯(lián)。通過免疫熒光染色、q-PCR、透射電鏡等研究，比對(duì)確認(rèn)結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，Tsg101以年齡依賴的方式參與維持卵母細(xì)胞質(zhì)膜的完整性和卵母細(xì)胞內(nèi)溶酶體的成熟。即Tsg101 在維持膜結(jié)構(gòu)完整性方面發(fā)揮著重要作用，這種作用會(huì)受小鼠卵母細(xì)胞年齡的影響。

結(jié)語
在胚胎發(fā)育過程的研究中，胚胎各階段的形態(tài)特征是評(píng)價(jià)其發(fā)育優(yōu)劣的重要依據(jù)，用于指導(dǎo)胚胎體外培養(yǎng)體系的優(yōu)化和改進(jìn)。JuLI™ Stage配置了4倍、10倍和20倍鏡以及相差功能，能夠滿足不同視場(chǎng)的觀察需求；可以箱內(nèi)長(zhǎng)時(shí)程成像，不影響胚胎發(fā)育的前提下，跟蹤記錄發(fā)育過程的形態(tài)特征，為胚胎發(fā)育評(píng)估和體外培養(yǎng)體系的優(yōu)化提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)
①Sozen, B., Jorgensen, V., Weatherbee, B.A.T. et al. Reconstructing aspects of human embryogenesis with pluripotent stem cells. Nat Commun 12, 5550 (2021). doi：10.1038/s41467-021-25853-4
②Shin H, Park D, Kim J, Nam MY, Kwon S, Um DE, Oh JE, Youn E, Shim YH, Wagner KU, Jun JH, Kim HR, Song H, Lim HJ. Peripubertal requirement of Tsg101 in maintaining the integrity of membranous structures in mouse oocytes. Cell Prolif. 2022 Oct;55(10):e13288. doi: 10.1111/cpr.13288.