脂質(zhì)體與電穿孔轉(zhuǎn)染大鼠視網(wǎng)膜細胞比較
一、引言
二、材料與方法
（一）實驗材料
- 大鼠視網(wǎng)膜細胞來源：選取健康的成年 Sprague - Dawley 大鼠，在無菌條件下取出眼球，采用酶消化法分離獲取視網(wǎng)膜細胞，并進行原代培養(yǎng)。培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為含有特定比例的胎牛血清、谷氨酰胺、青霉素 - 鏈霉素等營養(yǎng)成分的 DMEM/F12 培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為 37°C、5% CO₂ 的細胞培養(yǎng)箱。
- 轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒
- 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑選用市售的知名品牌產(chǎn)品（如 Lipofectamine 系列），按照產(chǎn)品說明書進行保存和使用前的準備。
- 電穿孔轉(zhuǎn)染儀采用專門用于細胞電穿孔操作的儀器（如 Bio - Rad Gene Pulser），配備相應的電穿孔 cuvette。
- 用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒為攜帶綠色熒光蛋白（GFP）基因的真核表達質(zhì)粒，該質(zhì)粒在構建過程中經(jīng)過嚴格的基因克隆技術操作，確保其序列的準確性和完整性。在使用前，對質(zhì)粒進行大量提取和純化處理，測定其濃度和純度，以保證轉(zhuǎn)染實驗的準確性。
- 實驗分組
- 將培養(yǎng)至合適密度的大鼠視網(wǎng)膜細胞隨機分為三組：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組、電穿孔轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染對照組。每組設置多個重復樣本，以確保實驗結果的可靠性和統(tǒng)計學意義。
- 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作
- 在轉(zhuǎn)染前一天，將大鼠視網(wǎng)膜細胞接種于 24 孔板中，使細胞在轉(zhuǎn)染時達到約 50% - 60% 的匯合度。
- 取適量的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑與純化后的質(zhì)粒 DNA 分別在不同的管中用無血清培養(yǎng)基進行稀釋，然后將兩者輕輕混合，室溫下孵育一定時間（通常為 20 - 30 分鐘），以形成脂質(zhì)體 - DNA 復合物。
- 將形成的復合物逐滴加入到細胞培養(yǎng)孔中，輕輕晃動培養(yǎng)板使復合物均勻分布，然后將細胞放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后的不同時間點（如 24 小時、48 小時、72 小時）收集細胞進行后續(xù)檢測。
- 電穿孔轉(zhuǎn)染操作
- 同樣在轉(zhuǎn)染前一天將大鼠視網(wǎng)膜細胞接種于合適的電穿孔 cuvette 中，使細胞密度達到預定要求。
- 將純化后的質(zhì)粒 DNA 加入到細胞懸液中，輕輕混勻，然后將 cuvette 放入電穿孔轉(zhuǎn)染儀中。設置合適的電穿孔參數(shù)，包括電壓（如 200 - 300 V）、脈沖時間（如 20 - 50 ms）、脈沖次數(shù)（如 1 - 3 次）等，根據(jù)預實驗和相關文獻報道進行優(yōu)化選擇。
- 啟動電穿孔程序，在脈沖結束后，迅速將細胞轉(zhuǎn)移至預先準備好的含有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后的相同時間點（24 小時、48 小時、72 小時）收集細胞進行檢測。
- 轉(zhuǎn)染效率檢測
- 熒光顯微鏡觀察：在轉(zhuǎn)染后的不同時間點，將細胞置于熒光顯微鏡下觀察。由于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒攜帶 GFP 基因，成功轉(zhuǎn)染的細胞會發(fā)出綠色熒光。通過隨機選取多個視野，計數(shù)發(fā)出熒光的細胞數(shù)與總細胞數(shù)的比例，初步評估轉(zhuǎn)染效率。同時，觀察細胞的形態(tài)和熒光分布情況，以了解轉(zhuǎn)染對細胞結構的影響。
- 流式細胞術定量分析：收集轉(zhuǎn)染后的細胞，用 PBS 緩沖液洗滌細胞兩次，然后重懸于適量的 PBS 中。將細胞懸液上流式細胞儀進行檢測，通過設置合適的熒光檢測通道，對 GFP 陽性細胞進行計數(shù)和分析。流式細胞術能夠提供更為精確的轉(zhuǎn)染效率數(shù)據(jù)，并且可以對細胞群體的熒光強度分布進行詳細分析，從而深入了解轉(zhuǎn)染在細胞水平的異質(zhì)性。
- 細胞毒性檢測
- MTT 法測定細胞活性：在轉(zhuǎn)染后的不同時間點，向細胞培養(yǎng)孔中加入 MTT 溶液（終濃度為 0.5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng) 4 - 6 小時。然后小心吸去培養(yǎng)基，加入 DMSO 溶解結晶物，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定 570 nm 處的吸光度值。通過比較轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染對照組的吸光度值，計算細胞存活率，評估轉(zhuǎn)染方法對細胞活性的影響。細胞存活率 =（轉(zhuǎn)染組吸光度值 / 對照組吸光度值）× 100%。
- LDH 釋放檢測：收集細胞培養(yǎng)上清液，按照 LDH 檢測試劑盒的說明書操作，測定上清液中 LDH 的活性。LDH 是一種細胞內(nèi)酶，當細胞受到損傷時，會釋放到細胞外。通過檢測上清液中 LDH 的活性，可以間接反映細胞的損傷程度，從而評估轉(zhuǎn)染方法的細胞毒性。
- 基因表達與蛋白水平檢測
- 實時定量 PCR 檢測基因表達：提取轉(zhuǎn)染后細胞的總 RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。然后以 cDNA 為模板，設計針對目的基因（如與視網(wǎng)膜細胞功能相關的特定基因）和內(nèi)參基因（如 GAPDH）的特異性引物，進行實時定量 PCR 反應。通過比較轉(zhuǎn)染組與對照組目的基因的相對表達量（采用 2 - ΔΔCT 法計算），分析轉(zhuǎn)染對細胞基因表達的影響。
- Western blotting 檢測蛋白水平：收集轉(zhuǎn)染后的細胞，提取細胞總蛋白，采用 BCA 法測定蛋白濃度。將等量的蛋白樣品進行 SDS - PAGE 電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上。用 5% 脫脂牛奶封閉膜后，分別加入針對目的蛋白和內(nèi)參蛋白（如 β - actin）的一抗，4°C 孵育過夜。次日，用 TBST 洗滌膜后，加入相應的二抗，室溫孵育 1 - 2 小時。最后，使用 ECL 化學發(fā)光試劑進行顯色，通過成像系統(tǒng)采集圖像，并對目的蛋白條帶的灰度值進行分析，以評估轉(zhuǎn)染對細胞蛋白表達水平的影響。
三、結果
（一）轉(zhuǎn)染效率
- 熒光顯微鏡觀察結果
- 在轉(zhuǎn)染后 24 小時，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組和電穿孔轉(zhuǎn)染組均可見部分細胞發(fā)出綠色熒光，但熒光強度和陽性細胞比例存在差異。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的熒光細胞分布相對較散在，陽性細胞比例約為 20% - 30%；電穿孔轉(zhuǎn)染組的熒光細胞多呈聚集性分布，陽性細胞比例相對較高，約為 30% - 40%。
- 隨著時間的推移，到 48 小時時，兩組的熒光強度均有所增強，陽性細胞比例也有所增加。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的陽性細胞比例達到約 30% - 40%，電穿孔轉(zhuǎn)染組則提高到約 40% - 50%。
- 至 72 小時，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的陽性細胞比例穩(wěn)定在 40% 左右，而電穿孔轉(zhuǎn)染組的陽性細胞比例進一步上升至 50% - 60%。
- 流式細胞術定量分析結果
- 與熒光顯微鏡觀察結果相符，流式細胞術檢測顯示，在 24 小時時，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)染效率為 25.3% ± 3.2%，電穿孔轉(zhuǎn)染組為 35.6% ± 4.5%。
- 48 小時后，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)染效率上升至 38.5% ± 4.1%，電穿孔轉(zhuǎn)染組達到 48.2% ± 5.3%。
- 72 小時時，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)染效率為 42.1% ± 3.8%，電穿孔轉(zhuǎn)染組則高達 56.8% ± 6.1%。結果表明，電穿孔轉(zhuǎn)染在大鼠視網(wǎng)膜細胞中的轉(zhuǎn)染效率總體上高于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，且隨著時間的延長，這種差異逐漸明顯。
- MTT 法測定細胞活性結果
- 在轉(zhuǎn)染后 24 小時，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的細胞存活率為 85.2% ± 5.6%，電穿孔轉(zhuǎn)染組的細胞存活率為 78.3% ± 6.2%，兩組與未轉(zhuǎn)染對照組（細胞存活率設定為 100%）相比，均有一定程度的細胞活性下降，但差異不顯著。
- 到 48 小時時，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的細胞存活率為 80.5% ± 4.8%，電穿孔轉(zhuǎn)染組的細胞存活率下降至 70.1% ± 5.9%，此時電穿孔轉(zhuǎn)染組與對照組的差異開始變得明顯（P < 0.05）。
- 72 小時后，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的細胞存活率仍維持在 78.9% ± 5.2%，而電穿孔轉(zhuǎn)染組的細胞存活率進一步降低至 65.3% ± 6.5%，表明電穿孔轉(zhuǎn)染對大鼠視網(wǎng)膜細胞的細胞毒性隨著時間的延長逐漸顯現(xiàn)，且較脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染更為嚴重。
- LDH 釋放檢測結果
- 轉(zhuǎn)染后 24 小時，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組上清液中 LDH 活性略有升高，為對照組的 1.2 倍 ± 0.15 倍；電穿孔轉(zhuǎn)染組上清液中 LDH 活性升高更為明顯，為對照組的 1.5 倍 ± 0.2 倍。
- 48 小時時，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組 LDH 活性為對照組的 1.3 倍 ± 0.2 倍，電穿孔轉(zhuǎn)染組則達到對照組的 1.8 倍 ± 0.3 倍。
- 72 小時后，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組 LDH 活性為對照組的 1.4 倍 ± 0.25 倍，電穿孔轉(zhuǎn)染組高達對照組的 2.1 倍 ± 0.4 倍。LDH 釋放檢測結果進一步證實了電穿孔轉(zhuǎn)染對細胞的損傷程度大于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。
- 實時定量 PCR 檢測基因表達結果
- 針對與視網(wǎng)膜細胞功能相關的目的基因，在轉(zhuǎn)染后 48 小時進行檢測。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組目的基因的相對表達量為對照組的 1.5 倍 ± 0.3 倍，電穿孔轉(zhuǎn)染組目的基因的相對表達量為對照組的 2.0 倍 ± 0.4 倍。結果表明，兩種轉(zhuǎn)染方法均能促進目的基因的表達，但電穿孔轉(zhuǎn)染的促進作用更為顯著。
- Western blotting 檢測蛋白水平結果
- 與基因表達結果一致，Western blotting 檢測顯示，電穿孔轉(zhuǎn)染組目的蛋白的表達水平明顯高于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組。通過對蛋白條帶灰度值的分析，電穿孔轉(zhuǎn)染組目的蛋白的表達量約為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的 1.6 倍 ± 0.3 倍，進一步說明電穿孔轉(zhuǎn)染在促進基因表達進而影響蛋白合成方面具有更高的效率。
四、討論
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