組織蛋白酶B：背后蘊藏的Linker“切割”力量
抗體偶聯藥物（Antibody-Drug Conjugate，ADC）是近年來腫瘤靶向治療領域發展最快的藥物類別之一。連接子(Linker)連接著細胞毒性藥物和抗體，是ADC藥物的關鍵部件之一。ADC中的連接子可分為可裂解和不可裂解兩種形式，目前的ADC研究主要集中在可裂解連接子上。而在可裂解連接子中，組織蛋白酶可裂解連接子是目前應用最廣泛以及研究最深入的，其中組織蛋白酶B發揮著至關重要的“切割”作用。
ADC藥物簡介
抗體偶聯藥物（Antibody-Drug Conjugate，ADC）由靶向腫瘤特異性抗原或者靶向腫瘤相關抗原的單克隆抗體(Antibody)，與不同數目的小分子細胞毒素(Payload)通過連接子(Linker)偶聯而成（圖1），兼具傳統小分子藥物的殺傷效應和抗體藥物的靶向性，已成為腫瘤靶向治療的重要藥物之一。ADC藥物的核心作用機制是在胞內釋放出活性細胞毒素(Payload)，干擾關鍵細胞機制，從而殺死靶細胞。因此，Payload的釋放機制是ADC藥物研發的關鍵點。
Payload的釋放機制因連接子類型而異。ADC中的連接子可分為可裂解和不可裂解兩種形式。可裂解連接子主要為敏感性的化學鍵，可以根據體內環境的特異性化學物種（如谷胱甘肽、酸堿性等）或酶濃度不同，促進連接子與藥物裂解，主要通過腙鍵、二硫鍵、多肽的形式連接。不可裂解連接子沒有可觸發裂解的內置化學鍵，需要在癌細胞的溶酶體中將抗體通過蛋白質水解機制變成氨基酸，進而釋放帶有連接子和氨基酸片段的細胞毒性藥物，主要通過硫醚的形式連接。
【可裂解連接子】
腙鍵特點：對pH值敏感。在血液環境（pH 7.35-7.45）穩定，而在酸性細胞區室，例如溶酶體(pH 4.5-5.0)中會被水解釋放Payload; 腙鍵連接子在血液循環過程中并不穩定，易造成脫靶效應，目前其應用主要局限于血液瘤。
二硫鍵特點：可被谷胱甘肽(GSH)還原裂解。胞外體液環境中谷胱甘肽的濃度為2-20μmo/L，遠低于細胞質中谷胱甘肽的濃度(1-10 mmol/L)，而腫瘤細胞中GSH濃度會更高，從而還原切割二硫鍵，促進Payload的釋放。因此，二硫鍵連接子在循環系統中相對穩定，并具有一定腫瘤特異性。
糖苷鍵特點：可被β-葡萄糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶切割。含有β-葡萄糖醛酸的連接子具有很高的親水性，可減少ADC的聚集，同時具有很好的穩定性。
肽鍵特點：可被組織蛋白酶B切割，這是一種溶酶體蛋白酶，在腫瘤細胞中過度表達，而在血液中存在蛋白酶抑制劑。因此，這種連接子在循環系統中高度穩定，而進入腫瘤細胞后會被溶酶體組織蛋白酶B切割，從而實現細胞毒性藥物在癌細胞中靶向釋放的功能。
【不可裂解連接子】
硫醚鍵特點：該類型連接子ADC的藥效發揮依賴于內吞機制，經腫瘤細胞內吞后進入溶酶體，ADC的抗體部分被降解，釋放出包含細胞毒素、linker和氨基酸殘基的復合物。這種連接子在血液環境中更加穩定，但帶電荷的氨基酸殘基會影響細胞毒素的細胞穿透膜能力，導致其不能發揮效“旁觀者效應”。
目前，組織蛋白酶B可裂解連接子是應用最廣泛以及研究最深入的，同時也是目前唯一有實際應用于上市ADC藥物的酶裂解型連接子。目前全球已上市的ADC藥物達15款，其中有8款是組織蛋白酶B可裂解的Linker（表1）。下面，讓我們一起來揭開具有強大“切割”力量的組織蛋白酶B的神秘面紗。
表1 全球已上市的ADC藥物一覽
組織蛋白酶B：背后蘊藏的“切割”力量
組織蛋白酶B（Cathepsin B）是一種半胱氨酸組織蛋白酶，屬于半胱氨酸蛋白酶家族，是一種胞內酶，主要分布于細胞溶酶體中。在病變情況下，也會分泌到細胞膜外周微環境或者胞外。組織蛋白酶B由一個重鏈和一個輕鏈組成的二聚體，具有羧基肽酶和內肽酶活性。羧基肽酶活性使得組織蛋白酶B可選擇性識別某些氨基酸序列以切割序列 C 端側的肽鍵接頭，例如纈氨酸-瓜氨酸（Val-Cit）、纈氨酸-丙氨酸（Val-Ala）和甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸（GGFG）等。這些Linker在已獲批的ADC中廣泛應用，具體裂解過程如圖2所示。內肽酶活性則使組織蛋白酶B參與細胞外基質的降解，從而涉及腫瘤的侵襲和轉移。
圖2 組織蛋白酶B催化肽鍵連接子的裂解過程示意圖（來源：抗體偶聯藥物連接技術的研究進展）
由于組織蛋白酶B在多種腫瘤細胞中過表達，如乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、結直腸癌、宮頸癌、甲狀腺癌等，并且是一種特異性的胞內酶，因此是現在ADC藥物研發主要考慮的Linker裂解酶，可以實現特異性和高效的胞內切割。另外，其他處于早期研究的Linker裂解酶還有組織蛋白酶M、組織蛋白酶L、β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、硫酸酯酶、磷酸酶和天冬酰胺內肽酶（萊古酶）等。
IPHASE相關產品
鑒于此，IPHASE作為體外研究生物試劑引領者，憑借先進的設備、專業的技術人員和多年研發經驗，自主研發了重組人組織蛋白酶B（Human Cathepsin B），該產品采用HEK293細胞表達，更接近蛋白天然構象，可用于評估ADC藥物連接子切割效果，保證payload在胞內高效釋放；
IPHASE技術人員通過測定底物Z-RR-AMC的代謝減少速率來評估組織蛋白酶B的活性。孵育體系中組織蛋白酶B終濃度為2μg/ml，底物Z-RR-AMC終濃度為1μM，孵育時間為60min，最終測得組織蛋白酶B的活性為8000pmol/min/mg。
除了組織蛋白酶B（Cathepsin B）外，針對ADC藥物中payload其他釋放形式、代謝穩定性、血漿蛋白結合等方向的研究，IPHASE推出了肝溶酶體、肝S9、酸化肝勻漿液，肝微粒體及空白血漿等產品，全面助力客戶ADC藥物開發研究！
IPHASE/匯智和源憑借多年的研發經驗，推出了多領域、多種類的高端科研試劑，為藥物早期研發提供篩選工具，為生命科學領域的探索提供新材料、新方法和新手段，為食品、藥品、化學品等的遺傳毒性研究提供便捷產品，望廣大科研工作者來電咨詢，咨詢熱線400-127-6686。
參考資料：
[1] Zhiwen Fu, Shijun Li, Sifei Han, et al. Antibody drug conjugate: the“biological missile” for targeted cancer therapy. Signal Transduction and Targeted Therapy.2022,7(1):93
[2] 李云峰，辛杰，李靜，等. 抗體偶聯藥物連接技術的研究進展[J]．中國新藥與臨床雜志，2022, 41(12): 719-728.
[3] Mckertish, C.M.; Kayser, V. Advances and Limitations of Antibody Drug Conjugates for Cancer. Biomedicines 2021, 9, 872.
[4] Baah, S.; Laws, M.; Rahman, K.M. Antibody–Drug Conjugates—A Tutorial Review. Molecules. 2021, 26, 2943.
[5] Bargh J D, Isidro-LIobet A, Parker J S, et al. Cleavable linkers in antibody–drug conjugates. Chemical Society Reviews. 2019, 48(16):4361-4374.
[6] Zheng Su, Dian Xiao, Fei Xie, et al., Antibody-drug conjugates: Recent advances in linker chemistry. Acta Pharm Sin B. 2021.11(12): 3889-3907.
匯智和源，致力于為創新藥研發企業及生命科學研究機構提供高品質的生物試劑，IPHASE為公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。
ADC藥物簡介
抗體偶聯藥物（Antibody-Drug Conjugate，ADC）由靶向腫瘤特異性抗原或者靶向腫瘤相關抗原的單克隆抗體(Antibody)，與不同數目的小分子細胞毒素(Payload)通過連接子(Linker)偶聯而成（圖1），兼具傳統小分子藥物的殺傷效應和抗體藥物的靶向性，已成為腫瘤靶向治療的重要藥物之一。ADC藥物的核心作用機制是在胞內釋放出活性細胞毒素(Payload)，干擾關鍵細胞機制，從而殺死靶細胞。因此，Payload的釋放機制是ADC藥物研發的關鍵點。
圖1 ADC藥物的結構和功能示意圖（來源：Antibody drug conjugate: the“biological missile” for targeted cancer therapy）
Payload的釋放機制因連接子類型而異。ADC中的連接子可分為可裂解和不可裂解兩種形式。可裂解連接子主要為敏感性的化學鍵，可以根據體內環境的特異性化學物種（如谷胱甘肽、酸堿性等）或酶濃度不同，促進連接子與藥物裂解，主要通過腙鍵、二硫鍵、多肽的形式連接。不可裂解連接子沒有可觸發裂解的內置化學鍵，需要在癌細胞的溶酶體中將抗體通過蛋白質水解機制變成氨基酸，進而釋放帶有連接子和氨基酸片段的細胞毒性藥物，主要通過硫醚的形式連接。
【可裂解連接子】
腙鍵特點：對pH值敏感。在血液環境（pH 7.35-7.45）穩定，而在酸性細胞區室，例如溶酶體(pH 4.5-5.0)中會被水解釋放Payload; 腙鍵連接子在血液循環過程中并不穩定，易造成脫靶效應，目前其應用主要局限于血液瘤。
二硫鍵特點：可被谷胱甘肽(GSH)還原裂解。胞外體液環境中谷胱甘肽的濃度為2-20μmo/L，遠低于細胞質中谷胱甘肽的濃度(1-10 mmol/L)，而腫瘤細胞中GSH濃度會更高，從而還原切割二硫鍵，促進Payload的釋放。因此，二硫鍵連接子在循環系統中相對穩定，并具有一定腫瘤特異性。
糖苷鍵特點：可被β-葡萄糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶切割。含有β-葡萄糖醛酸的連接子具有很高的親水性，可減少ADC的聚集，同時具有很好的穩定性。
肽鍵特點：可被組織蛋白酶B切割，這是一種溶酶體蛋白酶，在腫瘤細胞中過度表達，而在血液中存在蛋白酶抑制劑。因此，這種連接子在循環系統中高度穩定，而進入腫瘤細胞后會被溶酶體組織蛋白酶B切割，從而實現細胞毒性藥物在癌細胞中靶向釋放的功能。
【不可裂解連接子】
硫醚鍵特點：該類型連接子ADC的藥效發揮依賴于內吞機制，經腫瘤細胞內吞后進入溶酶體，ADC的抗體部分被降解，釋放出包含細胞毒素、linker和氨基酸殘基的復合物。這種連接子在血液環境中更加穩定，但帶電荷的氨基酸殘基會影響細胞毒素的細胞穿透膜能力，導致其不能發揮效“旁觀者效應”。
目前，組織蛋白酶B可裂解連接子是應用最廣泛以及研究最深入的，同時也是目前唯一有實際應用于上市ADC藥物的酶裂解型連接子。目前全球已上市的ADC藥物達15款，其中有8款是組織蛋白酶B可裂解的Linker（表1）。下面，讓我們一起來揭開具有強大“切割”力量的組織蛋白酶B的神秘面紗。
表1 全球已上市的ADC藥物一覽
組織蛋白酶B：背后蘊藏的“切割”力量
組織蛋白酶B（Cathepsin B）是一種半胱氨酸組織蛋白酶，屬于半胱氨酸蛋白酶家族，是一種胞內酶，主要分布于細胞溶酶體中。在病變情況下，也會分泌到細胞膜外周微環境或者胞外。組織蛋白酶B由一個重鏈和一個輕鏈組成的二聚體，具有羧基肽酶和內肽酶活性。羧基肽酶活性使得組織蛋白酶B可選擇性識別某些氨基酸序列以切割序列 C 端側的肽鍵接頭，例如纈氨酸-瓜氨酸（Val-Cit）、纈氨酸-丙氨酸（Val-Ala）和甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸（GGFG）等。這些Linker在已獲批的ADC中廣泛應用，具體裂解過程如圖2所示。內肽酶活性則使組織蛋白酶B參與細胞外基質的降解，從而涉及腫瘤的侵襲和轉移。
圖2 組織蛋白酶B催化肽鍵連接子的裂解過程示意圖（來源：抗體偶聯藥物連接技術的研究進展）
由于組織蛋白酶B在多種腫瘤細胞中過表達，如乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、結直腸癌、宮頸癌、甲狀腺癌等，并且是一種特異性的胞內酶，因此是現在ADC藥物研發主要考慮的Linker裂解酶，可以實現特異性和高效的胞內切割。另外，其他處于早期研究的Linker裂解酶還有組織蛋白酶M、組織蛋白酶L、β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、硫酸酯酶、磷酸酶和天冬酰胺內肽酶（萊古酶）等。
IPHASE相關產品
鑒于此，IPHASE作為體外研究生物試劑引領者，憑借先進的設備、專業的技術人員和多年研發經驗，自主研發了重組人組織蛋白酶B（Human Cathepsin B），該產品采用HEK293細胞表達，更接近蛋白天然構象，可用于評估ADC藥物連接子切割效果，保證payload在胞內高效釋放；
IPHASE技術人員通過測定底物Z-RR-AMC的代謝減少速率來評估組織蛋白酶B的活性。孵育體系中組織蛋白酶B終濃度為2μg/ml，底物Z-RR-AMC終濃度為1μM，孵育時間為60min，最終測得組織蛋白酶B的活性為8000pmol/min/mg。
除了組織蛋白酶B（Cathepsin B）外，針對ADC藥物中payload其他釋放形式、代謝穩定性、血漿蛋白結合等方向的研究，IPHASE推出了肝溶酶體、肝S9、酸化肝勻漿液，肝微粒體及空白血漿等產品，全面助力客戶ADC藥物開發研究！
| 分類 | 名稱 | 規格 |
| 組織蛋白酶B | 人組織蛋白酶B, HEK293 | 10μg/50μg |
| 肝溶酶體 | 人/猴/犬/大鼠/小鼠 肝溶酶體 | 250μl, 2mg/ml |
| 酸化肝勻漿液 | 人/猴/犬/大鼠/小鼠 酸化肝勻漿液 | 10ml, 0.2g/ml |
| 肝S9 | 人/猴/犬/大鼠/小鼠/兔/小型豬 肝S9 | 0.5ml, 20mg/ml |
| 肝微粒體 | 人/猴/犬/大鼠/小鼠/兔/倉鼠/貓/小型豬 肝微粒體 | 0.5ml, 20mg/ml |
| 血漿 | 空白人/猴/犬/大鼠/小鼠血漿（PPB） | 5ml |
| 空白人/猴/犬/大鼠/小鼠血漿（穩定性專用） | 5ml |
參考資料：
[1] Zhiwen Fu, Shijun Li, Sifei Han, et al. Antibody drug conjugate: the“biological missile” for targeted cancer therapy. Signal Transduction and Targeted Therapy.2022,7(1):93
[2] 李云峰，辛杰，李靜，等. 抗體偶聯藥物連接技術的研究進展[J]．中國新藥與臨床雜志，2022, 41(12): 719-728.
[3] Mckertish, C.M.; Kayser, V. Advances and Limitations of Antibody Drug Conjugates for Cancer. Biomedicines 2021, 9, 872.
[4] Baah, S.; Laws, M.; Rahman, K.M. Antibody–Drug Conjugates—A Tutorial Review. Molecules. 2021, 26, 2943.
[5] Bargh J D, Isidro-LIobet A, Parker J S, et al. Cleavable linkers in antibody–drug conjugates. Chemical Society Reviews. 2019, 48(16):4361-4374.
[6] Zheng Su, Dian Xiao, Fei Xie, et al., Antibody-drug conjugates: Recent advances in linker chemistry. Acta Pharm Sin B. 2021.11(12): 3889-3907.
匯智和源，致力于為創新藥研發企業及生命科學研究機構提供高品質的生物試劑，IPHASE為公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。
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