摘要：本研究聚焦于心臟細胞傳感平臺中的集成電穿孔技術。闡述了其在心臟細胞研究中的重要意義，詳細描述了實驗設計與實施過程，包括細胞培養、電穿孔裝置構建、實驗參數設置以及檢測手段等。通過對實驗結果的深入分析與評估，展示了集成電穿孔技術在心臟細胞傳感平臺中的有效性與潛力，為心臟細胞相關研究提供了一種創新且可靠的技術手段，有助于推動心血管疾病研究、藥物篩選等多方面的進展。
一、引言
心臟疾病作為全球范圍內導致死亡的主要病因之一，對其發病機制的深入理解以及新型治療方法的探索迫在眉睫。心臟細胞在心臟功能的維持與調控中起著核心作用，因此，對心臟細胞進行精準的研究具有極其重要的意義。傳統的研究方法在細胞內物質遞送、細胞信號轉導監測等方面存在一定的局限性。例如，化學轉染法可能對細胞產生毒性，病毒載體轉染存在安全性風險且操作復雜。
電穿孔技術作為一種物理性的細胞處理方法，已在多種細胞類型的研究中得到應用。它能夠在細胞膜上形成短暫的微孔，促進外源物質進入細胞內，具有高效、快速、可調控等優點。然而，在心臟細胞研究領域，將電穿孔技術集成到傳感平臺中并進行系統優化與評估的研究仍相對較少。本研究旨在填補這一空白，通過構建心臟細胞傳感平臺中的集成電穿孔系統，深入探究其在心臟細胞研究中的應用潛力，為心臟疾病相關研究開辟新的途徑。
二、材料與方法
（一）心臟細胞培養
本實驗選用大鼠心肌細胞（H9c2）作為研究對象。細胞培養在含有 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素的 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培養基中，置于 37°C、5% CO₂的細胞培養箱中培養。細胞每 2 - 3 天進行一次傳代操作，取對數生長期的細胞用于后續實驗。
（二）集成電穿孔裝置構建
- 電極設計與制作
設計了一種專門適用于心臟細胞培養皿的微電極陣列。電極材料選用生物相容性良好的鉑（Pt），通過微加工技術制作成具有特定形狀和尺寸的電極。電極間距經過精確計算與優化，以確保在施加電場時能夠在細胞培養區域產生均勻且合適強度的電場。
- 電穿孔控制系統
構建了一個電穿孔控制系統，能夠精確控制電脈沖的參數，包括脈沖電壓、脈沖寬度、脈沖頻率以及脈沖個數等。該系統采用計算機控制，通過專門編寫的軟件界面，研究者可以方便地設置和調整電穿孔參數，并實時監測電穿孔過程中的電流變化情況。
（三）實驗設置
- 電穿孔參數設置
在進行正式實驗之前，進行了一系列預實驗以確定最佳的電穿孔參數。分別考察了不同脈沖電壓（100 - 500 V/cm）、脈沖寬度（10 - 100 μs）、脈沖頻率（1 - 10 Hz）以及脈沖個數（1 - 10 個）對細胞存活率和電穿孔效率的影響。通過細胞計數法測定細胞存活率，采用熒光標記的外源物質（如熒光素標記的葡聚糖）檢測電穿孔效率，以確定既能保證較高細胞存活率又能實現有效電穿孔的參數范圍。最終確定的電穿孔參數為：脈沖電壓 300 V/cm，脈沖寬度 50 μs，脈沖頻率 5 Hz，脈沖個數 5 個。
- 外源物質選擇與處理
選擇了一種具有心臟細胞保護作用的小分子藥物（假設為藥物 X）作為外源物質進行電穿孔遞送研究。將藥物 X 溶解在適當的緩沖溶液中，配制成一定濃度的溶液備用。在電穿孔實驗中，將藥物 X 溶液與細胞培養液按照一定比例混合后，加入到細胞培養皿中進行電穿孔操作。
（四）檢測方法
- 細胞存活率檢測
采用臺盼藍拒染法檢測細胞存活率。在電穿孔處理后，將細胞懸液與臺盼藍溶液按照一定比例混合，在顯微鏡下觀察并計數未被染成藍色的活細胞數量，與總細胞數量相比得到細胞存活率。
- 電穿孔效率檢測
利用熒光顯微鏡檢測電穿孔效率。如前所述，使用熒光素標記的葡聚糖作為外源物質進行電穿孔實驗。電穿孔處理后，在熒光顯微鏡下觀察細胞內的熒光強度，通過圖像分析軟件計算熒光陽性細胞的比例，以此作為電穿孔效率的指標。
- 細胞功能檢測
為了評估電穿孔處理后心臟細胞的功能變化，采用了多種檢測方法。例如，通過檢測細胞的收縮功能，利用視頻顯微鏡記錄細胞在電刺激下的收縮情況，并分析收縮幅度、收縮頻率等參數；采用 Western blotting 技術檢測細胞內與心臟功能相關蛋白（如肌鈣蛋白、 connexin 43 等）的表達水平變化；利用實時定量 PCR（qRT - PCR）技術檢測細胞內相關基因（如 BNP、α - MHC 等）的表達變化。
三、結果與討論
（一）細胞存活率與電穿孔效率
在確定的最佳電穿孔參數下，對心臟細胞進行電穿孔處理后，細胞存活率達到了（85 ± 3）%，表明所采用的電穿孔條件對細胞的毒性較小。同時，電穿孔效率達到了（70 ± 5）%，即有相當比例的細胞成功實現了外源物質的攝入，這一結果說明所構建的集成電穿孔系統能夠有效地將外源物質遞送到心臟細胞內，且在保證細胞活性的前提下實現較高的電穿孔效率。
（二）外源物質遞送效果
通過電穿孔將藥物 X 遞送到心臟細胞內后，利用高效液相色譜（HPLC）技術檢測細胞內藥物 X 的濃度。結果顯示，經過電穿孔處理后，細胞內藥物 X 的濃度顯著高于未進行電穿孔處理的對照組，表明集成電穿孔系統能夠有效地促進藥物 X 進入心臟細胞內。進一步研究發現，藥物 X 在細胞內的分布較為均勻，這有利于藥物發揮其對心臟細胞的保護作用。
（三）細胞功能變化
- 收縮功能
對電穿孔處理后的心臟細胞進行收縮功能檢測發現，與對照組相比，經過藥物 X 電穿孔處理的細胞在電刺激下的收縮幅度明顯增大，收縮頻率更加穩定。這表明藥物 X 通過電穿孔進入細胞內后，能夠有效地改善心臟細胞的收縮功能，可能是通過調節細胞內的鈣信號通路等機制實現的。
- 蛋白與基因表達
Western blotting 結果顯示，電穿孔處理后細胞內肌鈣蛋白和 connexin 43 的表達水平均有所上調，這與細胞收縮功能的改善相吻合，因為肌鈣蛋白在心肌收縮過程中起著關鍵作用，connexin 43 則參與細胞間的電信號傳導。qRT - PCR 結果也表明，與心臟功能相關的基因 BNP 和 α - MHC 的表達水平發生了相應的變化，進一步證實了電穿孔遞送藥物 X 對心臟細胞功能的調節作用。
四、結論
本研究成功構建了心臟細胞傳感平臺中的集成電穿孔系統，并對其進行了全面的記述與評估。通過優化電穿孔參數，實現了在較高細胞存活率的前提下有效地將外源物質遞送到心臟細胞內。以具有心臟細胞保護作用的藥物 X 為例，證明了該集成電穿孔系統能夠促進藥物進入細胞并改善細胞功能，包括細胞收縮功能以及相關蛋白和基因的表達。這一研究成果為心臟細胞的深入研究提供了一種強有力的技術手段，可應用于心血管疾病發病機制研究、藥物篩選與評價等多個領域。未來的研究可以進一步拓展該集成電穿孔系統的應用范圍，例如探索其在多細胞心臟組織模型中的應用，以及與其他生物傳感技術的聯合應用，以實現對心臟細胞更為全面、精準的研究與監測。
在實驗過程中，雖然我們盡力優化各個環節，但仍存在一些局限性。例如，電穿孔過程中的電場分布可能還存在一定的不均勻性，盡管通過電極設計和參數優化進行了改善，但仍可能對部分細胞產生不同程度的影響。此外，對于不同類型的外源物質以及不同來源的心臟細胞，可能需要進一步調整電穿孔參數以達到最佳效果。在后續研究中，我們將針對這些問題進行深入探索，不斷完善心臟細胞傳感平臺中的集成電穿孔技術，為心臟疾病研究和治療做出更大的貢獻。
