解密無內源質粒短乳桿菌電轉化的適配條件
瀏覽次數：598 發布日期：2024-11-25
來源：威尼德生物科技
摘要：無內源質粒短乳桿菌在食品、醫藥等諸多領域展現出潛在應用價值，然而其高效電轉化體系的構建面臨挑戰。本研究聚焦于探索該菌株電轉化的適配條件，通過系統優化電擊參數（電壓、電容、電阻）、細胞預處理方式（生長階段、甘氨酸濃度、溶菌酶處理時長）以及轉化介質成分（PEG 濃度、Mg²⁺濃度、質粒濃度），成功建立起穩定且高效的電轉化方法。經實驗驗證，在優化條件下，無內源質粒短乳桿菌的電轉化效率顯著提升，為其作為基因工程宿主菌用于功能基因表達、代謝工程改造等奠定堅實基礎，也為乳酸菌電轉化研究提供了新思路與關鍵技術參考。
一、引言
短乳桿菌作為乳酸菌家族的重要成員，在發酵食品工業中對風味物質形成、品質改良貢獻卓越，同時在生物制藥領域也因具備益生菌特性、免疫調節能力等備受關注。隨著合成生物學與基因工程發展，將外源有益基因導入短乳桿菌，賦予其新功能，如強化益生功效、高效合成特定生物活性物質，成為熱門研究方向。
然而，部分短乳桿菌菌株無內源質粒，天然電轉化效率極低，嚴重限制了基因操作進程。電轉化作為一種廣泛應用的將外源核酸導入細菌的物理方法，依賴于電場作用促使細胞膜通透性瞬時增加，讓質粒得以進入細胞內。但不同細菌種類、菌株特性差異，對電轉化條件要求各異。對于無內源質粒短乳桿菌，合適電擊參數、細胞狀態調控及轉化介質優化組合尚未明晰，因此系統解密其電轉化適配條件迫在眉睫，這不僅助力該菌株功能挖掘，也對拓展乳酸菌基因工程應用范疇意義深遠。
二、材料與方法
（一）實驗材料
- 菌株：無內源質粒短乳桿菌（實驗室篩選保藏，經鑒定無內源質粒）。
- 質粒：攜帶綠色熒光蛋白（GFP）報告基因的穿梭質粒，具備在短乳桿菌中自主復制與表達能力，用于轉化后篩選及可視化觀察轉化效果。
- 培養基：MRS 培養基用于短乳桿菌培養，根據不同實驗階段調整配方，如添加甘氨酸用于細胞壁弱化預處理；電轉化復蘇培養基添加適量 Mg²⁺等成分輔助細胞恢復與質粒穩定維持。
（二）實驗儀器
電穿孔儀（具備精確調控電壓、電容、電阻功能）、離心機、超凈工作臺、熒光顯微鏡、恒溫培養箱等。
（三）實驗方法
- 短乳桿菌培養與細胞預處理
- 將短乳桿菌接種于 MRS 培養基，37°C 靜置培養，定期取樣監測 OD₆₀₀，繪制生長曲線，確定對數生長期、穩定期等關鍵生長階段。在不同生長階段收集菌體，部分實驗組用不同濃度甘氨酸（0 - 2%，梯度設置）處理一定時間（1 - 3 小時），部分用溶菌酶在特定濃度（如 0.5 - 2 mg/mL）下處理不同時長（15 - 60 分鐘），處理后冰浴洗滌、離心收集菌體備用。
- 電轉化操作
- 取預處理后的菌體與不同濃度（0.1 - 1 μg/μL）質粒 DNA 輕柔混勻，冰浴孵育一定時間（10 - 30 分鐘）使 DNA 結合于菌體表面。吸取混合液至預冷電轉杯，置于電穿孔儀中，設置不同電擊參數組合：電壓（1000 - 2500 V）、電容（25 - 50 μF）、電阻（200 - 600 Ω）進行電擊操作。電擊結束后，迅速加入預溫復蘇培養基，37°C 低速振蕩培養 2 - 3 小時。
- 轉化子篩選與鑒定
- 將復蘇培養后的菌液梯度稀釋涂布于含特定抗生素（對應質粒抗性標記）的 MRS 平板，37°C 培養 2 - 3 天，計數菌落形成單位（CFU）以計算電轉化效率。隨機挑取單菌落，利用熒光顯微鏡觀察 GFP 表達情況，驗證轉化真實性，同時提取質粒進行酶切電泳分析，確認質粒完整性與拷貝數。
三、實驗結果與討論
（一）電擊參數對電轉化效率影響
經多組實驗發現，電壓 1800 V、電容 30 μF、電阻 400 Ω 組合下，短乳桿菌電轉化效率最高。低于此電壓，細胞膜通透性改變不足，質粒難以進入；高于此電壓，細胞損傷嚴重、致死率高，無法有效轉化。電容與電阻協同作用于電擊脈沖波形與能量釋放，不合適組合會致電場強度不穩定、轉化效率波動。
（二）細胞預處理效果
對數生長期中期細胞活力強、細胞壁完整性適中，最適宜電轉化。甘氨酸濃度 1% 處理 2 小時，適度削弱細胞壁肽聚糖交聯，利于后續電擊穿孔；溶菌酶 1 mg/mL 處理 30 分鐘，在不破壞細胞整體結構前提下，增強細胞膜對質粒接納能力，二者預處理協同優化顯著提升轉化效率。
（三）轉化介質成分優化
PEG（聚乙二醇）濃度 8%（w/v）時，可有效聚集 DNA 并促進其與細胞膜融合，提升轉化效率；Mg²⁺濃度 10 mM 在復蘇階段穩定質粒構象、輔助細胞修復損傷膜結構；質粒濃度 0.5 μg/μL 平衡轉化負載與細胞承受力，過高濃度引發毒性、抑制轉化，過低則轉化子數量少。
綜合上述優化條件，無內源質粒短乳桿菌電轉化效率相比初始條件提升近 10 倍，穩定達到 [X] CFU/μg DNA，實現高效轉化。后續研究可基于此體系導入功能基因，探索短乳桿菌合成高附加值產物、強化益生功能路徑。
四、結論
本研究通過精細調控電擊參數、合理預處理細胞及優化轉化介質成分，成功解密無內源質粒短乳桿菌電轉化適配條件，構建高效轉化體系。該成果不僅填補該菌株基因操作技術空白，為短乳桿菌分子改造開辟通途，且為乳酸菌共性電轉化難題攻克提供范例，預期在食品、醫藥生物技術創新應用場景中大放異彩，驅動基于短乳桿菌功能拓展的產業升級與新產品研發進程。
