原創 彪彪 文章來源：生物制品圈

摘要:嵌合抗原受體（CAR）-T細胞過繼免疫療法是一種有前景的癌癥治療方法，它利用基因工程化的T細胞攻擊腫瘤。然而，這種療法可能會有一些不良反應。來源于CAR-T細胞的外泌體是CAR-T細胞的潛在替代品，可能克服一些限制。外泌體是細胞釋放的小囊泡，可以攜帶多種分子，包括蛋白質、RNA和DNA。它們在細胞間通訊中扮演重要角色，并且可以用來向癌細胞輸送治療劑。應用來源于CAR-T細胞的外泌體可以使CAR-T細胞療法在臨床上更加可控和有效。外泌體是無細胞的，這意味著它們比CAR-T細胞更不可能引起不良反應。CAR-T細胞和外泌體的結合可能比單獨任一療法更有效地治療癌癥。外泌體可以向CAR-T細胞無法到達的癌細胞輸送治療劑。適當應用細胞和外泌體平臺可以使CAR-T細胞療法成為更實用的癌癥治療方法。這種組合療法可以為治療多種癌癥提供一種安全有效的方式。

1.引言

近年來，癌癥免疫療法已成為主要的治療選擇之一。其中最有前景的方法之一是嵌合抗原受體（CAR）-T細胞療法，該療法涉及工程化T細胞以靶向特定的癌細胞。然而，CAR-T細胞療法也可能產生一些不良反應，如細胞因子釋放綜合征（CRS）。CRS的特點是細胞因子的快速和過量釋放，導致細胞因子風暴。當大量的促炎和炎癥細胞因子，如白細胞介素-2（IL-2）、可溶性IL-2受體α（可溶性IL-2Rα）、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、可溶性IL-6R和粒-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）被釋放到血液中時，就會發生細胞因子風暴。細胞因子風暴觸發免疫反應，引起廣泛的炎癥和免疫細胞的激活。這種免疫超激活可能會攻擊重要器官，包括肺、肝、腎、心、腦和中樞神經系統。外泌體是體內許多細胞分泌的一種細胞外囊泡。它們已被證明在細胞間通訊中發揮作用，并且可能能夠向癌細胞輸送治療性貨物。使用來源于CAR-T細胞的外泌體作為一種治療方法，可能會提供更多的治療過程控制，并幫助降低不良反應的風險。外泌體是癌癥免疫療法中的一個有前景的新研究點，它們有可能徹底改變癌癥的治療方法。本綜述聚焦于CAR-T細胞和來源于CAR-T細胞的外泌體在癌癥模型中的治療潛力。

2.外泌體概述（內容、生物合成和攝取）

細胞外囊泡（EVs）的分類主要分為兩大類：外泌體和外泌體。外泌體通過質膜的外向出芽形成，形成大小范圍約為50納米至1微米的微囊泡，而內源性的外泌體則來源于內質網，其大小范圍為40納米至約160納米（平均約100納米）。多年來，已確定這兩種外泌體分類在生理和病理上都發揮作用。但在過去十年中，越來越多的證據表明，膜囊泡是細胞間通訊中的重要信使。外泌體是這些囊泡中最被研究和特征明確的。外泌體通過質膜的雙重內陷形成。首先，內陷形成一個杯狀結構，從早期分選內質體（ESEs）開始，它們通過跨高爾基體網絡和內質網的貢獻成熟為晚期分選內質體（LSEs），隨后，內質膜的內陷形成含有腔內囊泡（ILVs，未來的外泌體）的多囊泡體（MVBs）。最終，外泌體將通過MVB與質膜的融合被釋放（圖1）。由于大小差異、內容、細胞起源和在受體細胞中的功能，外泌體是異質的。它們的大小異質性來自于外泌體內容物在MVBs中的不均勻內陷。外泌體的內容物可能因其功能而異；通常，外泌體具有以下貨物：膜蛋白、細胞質和核蛋白，以及細胞外基質和核酸，如mRNA、非編碼RNA種類和DNA。它們對受體細胞的作用和影響也可能因細胞表面受體而異，可以誘導細胞存活、凋亡和免疫調節。關于外泌體，異質性也可以由它們的細胞起源引起。外泌體的攝取與多種機制有關，如依賴于clathrin的內吞作用、吞噬作用和微囊泡吞噬作用。外泌體具有多種表面分子，使它們能夠與許多受體細胞相互作用。這意味著外泌體可以向不同細胞傳遞多種信號，或者在細胞上沒有生理功能，僅作為營養水平的放大器。

圖1 外泌體、微囊泡和凋亡小體是不同類型胞外囊泡（EVs），在細胞間通訊中扮演重要角色。外泌體是通過內膜向內出芽形成的小囊泡，而微囊泡是通過質膜向外出芽形成的較大囊泡。凋亡小體是在程序性細胞死亡過程中釋放的囊泡。這些EVs攜帶各種分子，并且可以被鄰近細胞攝取，促進通訊和生物材料的轉移。

3.外泌體的生物學功能

如前所述，外泌體具有生理和病理屬性。它們可以攜帶多種分子，包括microRNAs、mRNAs和蛋白質。外泌體可以將這些分子傳遞給其他細胞，這些細胞隨后可以使用它們來改變它們的行為。這個過程被稱為外泌體介導的細胞間通訊。外泌體可以與近鄰的細胞通訊，也可以通過血液循環與身體其他部位的細胞通訊。外泌體甚至可以通過血腦屏障，該屏障將血液與大腦分開。有報道稱，外泌體是細胞間相互通訊的多功能方式。它們可以同時傳遞多個信號，并且可以針對多個細胞和多個位置。這使得外泌體成為細胞間通訊的強大工具。外泌體是一個迅速發展的研究領域。科學家們仍在了解它們的許多功能。然而，很明顯，外泌體在細胞間通訊和許多其他生物過程中發揮著重要作用。

美國食品藥品監督管理局批準了CAR-T細胞療法作為第一種基因療法。表達嵌合抗原受體（CAR）的基因工程T細胞作為一種有前途的新療法，正在迅速崛起，用于治療血液學和非血液學惡性腫瘤。在實體瘤中，CAR-T療法并未取得在血液學惡性腫瘤中觀察到的臨床成功。基于CAR的過繼免疫療法使用基因修飾的T淋巴細胞提供腫瘤靶向和免疫反應，可以作為活體藥物，對目標細胞進行持續的細胞毒性攻擊。CAR-T細胞及其在體內的復制可以增強細胞因子釋放，這不容易控制。這種效應是潛在的副作用來源，如CRS（細胞因子釋放綜合征）、細胞因子風暴和靶向腫瘤外的反應。

3.1.實體瘤癌癥

CAR-T細胞療法徹底改變了癌癥治療領域，特別是在血液學惡性腫瘤的管理中。然而，其在實體瘤中的應用由于腫瘤微環境的復雜性，如異質性和惡劣的腫瘤微環境，提出了獨特的挑戰。在目標識別、增強腫瘤滲透、管理毒性和探索聯合療法方面的進展，為CAR-T細胞療法在抗擊實體瘤中的有效使用帶來了希望，使我們更接近個性化和精確的癌癥治療。

目標選擇確實是CAR-T細胞療法在實體瘤中的一個重要障礙。實體瘤組織復雜的性質和不同腫瘤細胞中蛋白質表達譜的變異性，使得識別能夠有效覆蓋所有腫瘤細胞的目標變得具有挑戰性。即使抗原陽性的腫瘤細胞被消除，仍有大量抗原陰性細胞可能持續存在，導致腫瘤復發率高。

實體瘤目標選擇的困難之一是實體瘤細胞源自健康組織。許多在腫瘤細胞中高度表達的抗原也在正常細胞中少量表達。這在避免非特異性殺傷健康細胞方面提出了挑戰，導致靶向腫瘤外的副作用。腫瘤異質性是CAR-T細胞療法在實體瘤中的另一個重大挑戰。實體瘤通常表現出高水平的異質性，意味著同一患者內的不同腫瘤細胞可能不表達相同的腫瘤相關抗原。因此，如果CAR-T細胞識別單一目標來治療實體瘤，療法的成功可能取決于腫瘤的異質性。

CD133，一種新的腫瘤干細胞標記物，已被確定為在許多實體瘤中過表達的目標，并正在作為CAR-T細胞療法的目標進行探索。然而，實體瘤的高度異質性使得其治療比血液學惡性腫瘤更具挑戰性。關鍵挑戰在于選擇能夠有效解決實體瘤異質性和復雜性的目標。

已觀察到CAR-T細胞返回淋巴和血液系統，增加了遇到血液腫瘤細胞的可能性。CAR-T細胞療法在實體瘤中的成功取決于其穿透腫瘤組織通過血管內皮細胞的能力。

CAR-T細胞進入實體瘤的有限遷移和侵襲可以歸因于腫瘤微環境中存在的密集纖維化基質和促進T細胞滲透到腫瘤組織中的趨化因子的下調。

實體瘤中惡劣的免疫抑制腫瘤微環境進一步復雜化了CAR-T細胞療法。腫瘤微環境（TME）是一個復雜的環境，由各種細胞外基質、基質細胞、炎癥細胞和血管組成。在實體瘤中，TME的特點是血管化低、缺氧和細胞外基質濃度高。有幾個因素促成了免疫抑制TME，對CAR-T細胞療法提出了重大挑戰。實體瘤通常表現出酸性TME，這是由于增加的糖酵解和乳酸產生。低pH值抑制T細胞功能，并通過損害CAR-T細胞活性和細胞因子產生促進免疫逃逸。

在實體瘤中，TME的特點是難以獲得色氨酸，這是一種對T細胞最佳功能至關重要的必需氨基酸。腫瘤細胞和免疫抑制細胞，如骨髓源性抑制細胞（MDSCs），可以通過酶色氨酸2,3-雙加氧酶（IDO）消耗色氨酸，導致T細胞抑制。實體瘤通常在TME中有低氧水平（缺氧）區域。缺氧可以損害CAR-T細胞的功能和存活，降低其靶向腫瘤細胞的有效性。TME中的免疫抑制細胞，如調節性T細胞（Tregs）、MDSCs和腫瘤相關巨噬細胞（TAMs），分泌免疫抑制分子如轉化生長因子-β（TGF-β）、白介素-10（IL-10）和程序性細胞死亡配體1（PD-L1）。這些分子抑制CAR-T細胞活性，抑制免疫反應，并促進腫瘤免疫逃逸。

這些因素共同在實體瘤內創造了一個免疫抑制和惡劣的環境，阻礙了CAR-T細胞療法的效力。克服這些挑戰是研究的重點，涉及增強CAR-T細胞持久性、調節TME和將CAR-T療法與其他免疫調節方法相結合的策略，以改善實體瘤的治療結果。

3.2.肺癌治療

肺癌確實是全球最普遍且致死率最高的癌癥之一。不幸的是，大部分肺癌患者在晚期才被診斷出，此時治療選擇有限，導致5年生存率大約只有10-20%。盡管外科切除結合輔助治療仍是主要的治療策略，但只有少數患者符合手術條件，手術后的復發仍是一個重大問題。因此，迫切需要探索新的治療策略，以阻止腫瘤進展并改善肺癌患者的生存結果。

CAR-T細胞療法在血液惡性腫瘤中已證明成功，為治療實體瘤，包括肺癌，提供了新的希望。然而，它面臨著與其他實體瘤相似的挑戰，如前所述。此外，CAR-T細胞的臨床應用受到腫瘤溶解綜合征、神經毒性綜合征和細胞因子釋放綜合征等挑戰的阻礙。

根據提供的信息，對于患有肺癌的患者，有一系列潛在的腫瘤相關抗原（TAAs）可用于CAR-T細胞療法。值得注意的是，選擇CAR-T細胞療法的最佳TAA取決于多種因素，包括腫瘤的特定特征及其微環境。需要進一步的研究和臨床試驗來確定在CAR-T細胞療法中針對這些TAAs的療效和安全性：

• 表皮生長因子受體（EGFR）是一種在實體瘤中經常過表達的蛋白質，包括肺癌和腦轉移。EGFRvIII是EGFR的一種變體，在肺癌中尤為常見。針對EGFRvIII工程化的CAR-T細胞已被證明能有效殺死EGFRvIII陽性的肺癌細胞。這可能是預防手術后肺癌復發和轉移的潛在治療策略。
• 間皮素（MSLN）是一種細胞粘附糖蛋白，與肺癌患者的高腫瘤侵襲性和預后不良相關。它被認為是包括肺癌在內的實體瘤CAR-T療法的理想靶點。
• 黏蛋白1（MUC1）是一種跨膜蛋白，涉及癌細胞粘附和轉移。與正常肺組織相比，MUC1在肺癌組織中的表達顯著更高。它是肺癌CAR-T細胞療法的潛在靶點。
• 人表皮生長因子受體2（HER2）在肺癌中高度表達。它促進癌細胞的增殖、侵襲和血管生成。HER2可以作為肺癌診斷和治療的有希望的生物標志物。

3.3.乳腺癌

乳腺癌目前在全球女性癌癥中的發病率和死亡率最高。現有治療的耐藥性出現，強調了開發新療法的必要性。CAR-T細胞療法是一種利用患者免疫細胞對抗癌癥的免疫療法，已顯示出前景，并已廣泛應用于血液惡性腫瘤。其在治療實體瘤，包括乳腺癌中的應用勢頭增強。在乳腺癌細胞中，已鑒定出表達改變的特定分子作為CAR-T細胞療法的潛在靶點。十九種抗原，即HER2、EGFR、肝細胞生長因子受體/間充質-上皮轉化因子（HGFR/cMET）、酪氨酸蛋白激酶跨膜受體（ROR1）、AXL受體酪氨酸激酶（AXL）、MUC1、MSLN、CD70、CD133、CD44v6、上皮細胞粘附分子（EpCAM）、軟骨素硫酸蛋白聚糖4（CSGP4）、細胞間粘附分子1（ICAM1）、腫瘤內皮標記8（TEM8）、滋養層細胞表面抗原2（TROP2）、葉酸受體α（FRα）、自然殺傷組2成員D（NKG2D）、GD2和癌胚抗原（CEA），已作為乳腺癌CAR-T細胞療法的靶點進行研究。這些抗原大多屬于受體酪氨酸激酶家族和細胞表面蛋白。研究表明，所有19種抗原都顯示出抗腫瘤效應，抑制腫瘤生長并誘導促炎細胞因子的釋放。

盡管近年來CAR-T細胞療法取得了進展，但仍存在幾項挑戰，包括不充分的轉移和滲透、免疫抑制環境的存在、缺乏腫瘤特異性或腫瘤相關抗原以及CAR-T細胞毒性。

盡管CAR-T細胞療法在乳腺癌方面取得了顯著進展，但由于支持證據不足，其在臨床設置中的應用仍相距甚遠。為了加快CAR-T細胞療法在乳腺癌患者中的臨床實施，外泌體療法和臨床試驗對于解決安全問題和克服現有挑戰至關重要。

3.4.血液學和非霍奇金淋巴瘤（NHL）治療

CAR-T細胞免疫療法在治療血液惡性腫瘤方面取得了顯著成功，在臨床試驗中觀察到高緩解率。針對CD19的CAR-T細胞顯示出對耐藥性B細胞惡性腫瘤的持久緩解效果，復發和難治性急性B淋巴細胞性白血病的治愈率已達到大約80-90%。

CAR-T療法在血液惡性腫瘤，如急性淋巴細胞性白血病和大B細胞淋巴瘤中的成功，徹底改變了它們的治療。FDA批準針對CD19的CAR-T細胞用于治療復發或難治性兒童和年輕成人彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL），進一步驗證了這種方法的有效性。

CAR-T細胞療法在血液惡性腫瘤中的成功關鍵因素之一是存在單克隆疾病，其中單一靶抗原（如CD19）表達在所有腫瘤細胞表面。這使得CAR-T細胞能夠有效地靶向并消除癌細胞。為了克服這些挑戰，未來針對腫瘤的治療策略可能會涉及將基于免疫療法的治療，如CAR-T細胞療法，與其他治療方式相結合。

非霍奇金淋巴瘤（NHL）美國食品藥品監督管理局（FDA）最近批準的CD19特異性CAR-T細胞療法為化療耐藥性B細胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）和復發/難治性兒童及年輕成人彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）提供了有希望的治療。CD19是一個泛B細胞標記，在大多數B細胞NHL中高度表達，使其成為這些惡性腫瘤中CAR-T細胞療法的合適靶點。在急性淋巴細胞性白血病（ALL）的情況下，針對CD19的CAR-T細胞的臨床效果似乎比淋巴瘤更顯著。這可能是由于疾病生物學和治療反應的差異。另一方面，外周T細胞淋巴瘤患者呈現一組異質性疾病，通常預后較差，這對CAR-T細胞療法構成了挑戰。

CAR-T細胞療法已從第一代發展到第二代CAR-T細胞。第一代CAR-T細胞使用CD3z鏈作為信號域，而第二代CAR-T細胞增加了額外的共刺激域以增強其抗腫瘤活性。第二代CAR-T細胞療法顯示出更顯著的抗白血病反應，在復發B細胞ALL患者中高恢復率達到90%。然而，在具有高風險特征的個體中，如早期復發、難治性疾病和某些類型的淋巴瘤，治療結果仍然不佳。

目前，針對CD19的CAR-T細胞在約40%的化療耐藥性DLBCL、高級別B細胞淋巴瘤（HGBCL）和未經前期治療的原發性縱隔B細胞淋巴瘤（PMBCL）患者中顯示出持續的緩解率。這些產品也用于至少經過兩線前期治療后復發的侵襲性淋巴瘤患者。CAR-T細胞療法的進步為治療NHL患者提供了高效的解決方案。

3.5.前列腺癌

盡管在轉移性前列腺癌（mPCa）中使用CAR-T細胞療法的研究有限，但已對這種情況下CAR-T細胞療法的潛在靶點進行了研究。兩個重要的CAR-T細胞靶向抗原候選者是前列腺特異性膜抗原（PSMA）和前列腺干細胞抗原（PSCA）。體外和體內模型表明PSMA-CAR-T細胞可以增殖并識別PSMA陽性細胞。第二代CAR-T細胞顯示出比前幾代更好的殺傷效果，代表了mPCa的一種新的免疫靶向方法。

在前列腺癌（PCa）中，已確定幾種蛋白質由惡性細胞優先表達，包括前列腺特異性抗原（PSA）、前列腺酸性磷酸酶（PAP）、前列腺干細胞抗原（PSCA）、T細胞受體γ替代閱讀框蛋白（TARP）、瞬時受體電位（trp）-p8和前列腺特異性膜抗原（PSMA）。最近，各種研究探索了這些前列腺腫瘤相關抗原（TAAs）作為在PCa患者中誘導免疫反應的靶點。

總的來說，轉移性前列腺癌中CAR-T細胞療法的使用是一個積極研究的領域，雖然已經獲得了有希望的臨床前結果，但需要進一步調查以評估這種方法在臨床設置中的安全性和有效性。

3.6.膠質母細胞瘤

外泌體的使用為CAR-T細胞技術在實體瘤治療中的應用，包括針對特定區域的腫瘤，如膠質母細胞瘤（GBM），帶來了希望。雖然CAR-T細胞療法在GBM中的探索還處于早期階段，但初步結果已經顯示出使用這種方法的可行性、安全性甚至療效跡象。

在CAR-T細胞療法進一步開發用于GBM時，需要解決的幾個挑戰包括增強CAR T細胞對腫瘤的滲透、優化輸注劑量和頻率、調節免疫抑制性腫瘤微環境，以及解決GBM固有的分子異質性。此外，與GBM的免疫療法相關的一般挑戰，如管理合并類固醇使用、區分真正的腫瘤進展與放射影像假進展，以及識別潛在的反應生物標志物，需要在任何CAR-T細胞研究中考慮和解決。GBM的初始CAR靶標，如IL-13 Rα2、EGFRvIII和HER2，只是正在探索用于該疾病CAR靶向的潛在抗原的一些例子。針對ephrin-A2和EGFR的CAR-T細胞的臨床調查正在進行中，最近發現了新的抗原，如CD70。這些研究和其他研究的結果備受期待，以進一步推進我們對GBM CAR-T細胞療法的理解。

總之，盡管存在需要克服的挑戰，但早期結果已經顯示出CAR-T細胞療法在GBM中的前景。正在進行的臨床調查和探索新的抗原作為CAR靶點為這一具有挑戰性的疾病提供了改善療法的希望。

3.7.CAR-T細胞和溶瘤病毒治療

CAR-T細胞和溶瘤病毒（OVs）已顯示出針對血液和實體腫瘤的潛力。然而，作為單一療法，它們的效果有限，特別是在實體腫瘤的情況下。為了應對這一挑戰，癌癥基因治療領域一直在專注于開發包括化療、放療和其他免疫療法（如免疫檢查點抑制劑ICIs）在內的聯合治療策略。

將CAR-T細胞和OVs結合起來可能改善各種類型癌癥患者的治療結果。通過整合兩種方法的優勢，有潛力增強腫瘤靶向、免疫激活和治療效果。然而，需要進一步的研究和臨床試驗來評估這些聯合策略在更廣泛的癌癥類型和患者群體中的安全性、可行性和有效性。

3.8.CAR-T細胞療法的局限性

確實，為了充分發揮CAR-T細胞療法的潛力，需要解決幾個挑戰。其中一些挑戰包括理解腫瘤微環境。宿主腫瘤微環境在調節免疫反應中起著關鍵作用，可能影響CAR-T細胞療法的效果。另一個挑戰是擴大CAR-T療法的適用性，因為需要使CAR-T療法可用于治療更廣泛的人類癌癥。這涉及識別和測試新抗原以及優化CAR設計以針對特定類型的癌癥。此外，CAR-T療法目前成本高昂，對許多患者來說可能負擔不起。解決CAR-T細胞療法的定價和可負擔性問題是確保更廣泛獲取和可用性的關鍵。管理副作用是另一個問題；CAR-T細胞療法可能與副作用相關，如CRS、高燒、竇性心動過速、低血壓、低氧、神經毒性、心臟功能抑制、其他器官功能障礙和移植物抗宿主病（GVHD）。需要開發管理這些副作用的策略以提高患者安全和治療效果。

CAR-T細胞可能會經歷耗竭和衰老，導致功能減弱和療效降低。理解和解決T細胞耗竭對于最大化CAR-T細胞療法的長期效果至關重要。

增強對免疫檢查點阻斷的反應在癌癥治療中很重要。耗竭的T細胞可能會抑制效應免疫并降低對免疫檢查點阻斷療法的反應性。檢查點阻斷療法通過靶向調節T細胞反應的免疫檢查點，在癌癥治療中取得了重大突破。一項研究探討了免疫檢查點阻斷的重要性以及耗竭T細胞在抑制效應T細胞中的作用。這項研究重點關注了耗竭T細胞、針對程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）的免疫檢查點阻斷和激進癌癥干細胞（CSCs）的產生和維持之間的關系。CSCs是腫瘤內具有自我更新和腫瘤啟動能力的一小部分細胞，有助于腫瘤生長和治療抵抗。作者證明，對PD-1阻斷無反應的終末耗竭CD8+T細胞在促進激進CSCs的產生和維持中扮演了重要角色。他們發現，腫瘤微環境中耗竭CD8+T細胞的存在導致CSCs上免疫檢查點分子（如PD-L1）的表達增加。這種耗竭T細胞和CSCs之間的相互作用導致效應T細胞活性的抑制和增強CSC干細胞特性。

需要探索克服T細胞耗竭和增強對免疫檢查點抑制劑反應的策略，以改善聯合療法的結果。

應對這些挑戰將需要科學家、臨床醫生和行業合作伙伴之間的持續研究、創新和合作。盡管存在這些挑戰，對CAR-T細胞療法的日益增長的知識提供了寶貴的見解，可以指導該領域的進一步改進和進步。

4.CAR-T細胞衍生的外泌體的優勢

CAR-T細胞療法存在局限性，包括強烈的毒性、抗原逃逸和腫瘤浸潤的限制。然而，CAR-T細胞衍生的外泌體（EVs）提供了一種更安全且潛在有效的免疫療法選擇，在癌癥研究中引起了興趣。這些外泌體可以定制攜帶各種貨物，如針對腫瘤的受體、小干擾RNA（siRNAs）或細胞因子，這些物質增強了抗癌效果。CAR T細胞衍生的細胞外囊泡（EVs）的顯著益處包括安全性（無細胞性質）、易于修改、可檢測性和癌癥的特異性。以下段落將進一步解釋這一點，并在表1中描述。

4.1.更可控的條件

與輸注CAR表達T細胞相關的最嚴重的副作用之一是CAR-T細胞誘導的CRS。CRS的癥狀包括惡心、頭痛、心動過速、低血壓、皮疹和呼吸急促。這些癥狀是由免疫細胞分泌細胞因子引起的。細胞因子風暴是一種嚴重的CRS，經常導致低血壓和高燒，最終可能導致器官衰竭甚至死亡。幾乎三分之二的CAR-T細胞患者經歷了CRS，通常出現在細胞輸注后10天。在最初的CAR-T細胞臨床試驗中，有兩例報告的死亡。這種潛在致命的后果主要與CAR-T細胞不受控制的細胞因子分泌有關。首先，由大量輸注的抗腫瘤淋巴細胞（高達10^11）釋放的細胞因子引起的全身性炎癥反應類似于膿毒癥。如果細胞因子風暴導致心律失常、心臟驟停、肝衰竭或腎衰竭，接受者的生命可能處于危險之中。其次，CAR-T細胞可能會失控擴張，并表現為“活性藥物”，導致CRS。第二代和第三代CAR結構中成本刺激受體如CD28、4-1BB、DPA10、OX40或ICOS的作用顯著提高了反復抗原暴露后的絕對T細胞增殖。例如，在慢性淋巴細胞性白血病患者中，4-1BB整合的CD19 CAR-T細胞在給藥后可以增殖超過1000倍。CAR-T細胞的體內擴張被認為是必不可少的，并且與毒性和反應有關。在重癥監護室中，類固醇、升壓藥和IL-6阻斷劑以及支持性治療都已成功用于解決CRS相關問題。與傳統藥物引起的副作用不同，CAR-T細胞引起的毒性不能僅通過減少藥物劑量來控制。研究人員嘗試在CAR中加入自殺基因作為安全開關，以在極度毒性的情況下消除CAR-T細胞。這種策略涉及工程化CAR-T細胞，使其具有自殺基因，當出現不良反應時可以激活以誘導細胞死亡。包括這個安全開關，允許及時和控制性地消除CAR-T細胞，最小化對患者的潛在傷害。CAR-T細胞衍生的外泌體有潛力被用作對癌細胞的直接攻擊，使這些“活性藥物”更容易控制。這是因為外泌體具有與CAR-T細胞相同的生物學特性。CAR-T細胞衍生的外泌體可以通過直接攻擊腫瘤來控制CAR-T細胞誘導的毒性，并取代對免疫細胞的需求（圖2）。Zitvogel及其同事的初步研究提供了這一理論。在他們的體內研究中，用腫瘤肽脈沖的小鼠DC產生的外泌體導致了現有腫瘤的排斥。體外，DC產生的外泌體在誘導抗腫瘤免疫反應方面與具有相似數量的DCs（0.5×10^6至1×10^6 DCs）的細胞一樣有效。Peters等人的早期研究表明，人類T細胞產生的外泌體在細胞毒性T淋巴細胞（CTL）與其靶細胞之間的相互作用中至關重要。CTL的表面膜分子，如T細胞受體（TCR）、CD3和CD8，存在于CTL衍生的外泌體中。這些分子允許外泌體特異性地靶向和殺死腫瘤細胞。當外泌體與腫瘤細胞結合時，外泌體上的TCR與腫瘤細胞的抗原/MHC復合物相互作用。這種相互作用觸發了外泌體與腫瘤細胞之間的共軛形成。然后共軛對外泌體和腫瘤細胞傳遞致命一擊，導致其死亡。外泌體對外泌體靶向的腫瘤細胞傳遞的致命一擊是由蛋白質和其他分子的釋放引起的，包括穿孔素、顆粒酶和溶酶體酶。TCR激活刺激了CTL衍生的外泌體的產生，類似的工作已經證明TCR/CD3復合物存在于人類CTL衍生的外泌體的膜中。

圖2 A. 腫瘤微環境（TME）以有限的血管形成、低氧水平（缺氧）和豐富的細胞外基質成分為特征。缺氧可能會損害CAR-T細胞的功能和存活，降低其靶向腫瘤細胞的有效性。B. 一旦識別到腫瘤抗原，CAR T細胞通過釋放炎癥細胞因子啟動免疫反應。這觸發免疫細胞產生大量細胞因子，導致一種稱為細胞因子釋放綜合征（CRS）的狀況。CRS主要是由激活的免疫細胞（包括T細胞、巨噬細胞（MQ）、B細胞、單核細胞、自然殺傷細胞和樹突狀細胞（DC））釋放的眾多炎癥因子引起的全身性炎癥反應。CRS的臨床表現包括發熱和多個器官功能障礙。C. 外泌體與CAR-T細胞共享相似的特性，使它們成為控制CAR-T細胞誘導的毒性的潛在工具，通過直接靶向腫瘤并可能取代免疫細胞的需求。這些外泌體包含在T細胞上發現的表面膜分子，如T細胞受體（TCR）和CD8，使它們能夠選擇性地靶向并消除腫瘤細胞。外泌體與腫瘤細胞結合時，外泌體上的TCR與腫瘤細胞的抗原/MHC復合體相互作用，導致外泌體與腫瘤細胞之間形成共軛。這種共軛對外泌體和腫瘤細胞造成致命打擊，導致腫瘤細胞死亡。

與CAR-T細胞相比，CAR-T EVs和外泌體顯示出更低的毒性潛力。這使它們適合作為無細胞免疫療法劑，這可能簡化了監管批準，因為它們可能不被歸類為先進治療藥物產品。此外，CAR-T外泌體具有低免疫原性，允許它們在第三方環境中作為現成產品使用。與親代細胞不同，EVs和外泌體可以輕松穿透腫瘤屏障，即使是在具有顯著纖維反應的腫瘤中。研究表明，通過刺激生產細胞可以提高EV的產生和功能。在自體CAR生產中使用CAR-T EV療法消除了將腫瘤細胞重新引入患者的風險，這是CAR-T細胞療法的一個擔憂。已經觀察到，殘留的腫瘤細胞可能無意中獲得CAR表達，導致對CAR-T細胞療法產生抗藥性。來自T淋巴細胞的EVs表達TCR和促凋亡分子，賦予它們細胞毒性和抗原特異性。這表明CAR-T細胞衍生的EVs可以有效傳遞促凋亡信號到癌細胞。然而，CAR分子在CAR-T細胞衍生的EVs上的存在對于誘導特定的癌細胞死亡至關重要，類似于它們的親代CAR-T細胞。通過優化外泌體的釋放和表面CAR的表達，可以提高CAR表達外泌體的產生。TCR激活已被證明可以增加CTL衍生的外泌體的產生。另一方面，通過各種抗原刺激技術可以實現外泌體上更高水平的CAR表達。這些包括使用涂有重組CAR靶抗原的細胞珠或使用表達CAR抗原的細胞。這些策略可以幫助提高CAR表達外泌體產生的效果和效率。

盡管對CAR-T細胞衍生的外泌體的全面理解仍在研究中，但它們極有可能將抗原靶向的細胞毒性傳遞給癌細胞。這是因為它們表面含有可以與癌細胞結合的靶向分子，以及可以殺死癌細胞的細胞毒性分子。

4.2.直接攻擊者

CAR-T細胞療法在治療實體瘤方面的效果不如淋巴惡性腫瘤。多種癌癥的腫瘤微環境可能會干擾CAR-T細胞的抗癌功能，除了用于CAR構建的腫瘤抗原的特異性。CAR-T細胞與腫瘤細胞之間的細胞間相互作用是這種抗癌方法的關鍵需求。然而，實體瘤具有豐富的基質，CAR-T細胞必須穿透，這與淋巴惡性腫瘤不同。至少有兩種方式，實體瘤微環境限制了CAR-T細胞的有效性。首先，CAR-T細胞的功能可能受到腫瘤介導的免疫抑制的限制。腫瘤微環境通過影響CAR-T細胞的體外操作后的T淋巴細胞功能，從而干擾CAR-T細胞的效力的第二種機制。這可能使它們難以穿透實體瘤的細胞外基質（ECM）。Caruana等人提供了支持上述機制的直接證據。ECM的主要成分，肝素硫酸蛋白聚糖，被酶肝素酶（HPSE）降解，該酶被設計為在CAR-T細胞上表達。HPSE CAR-T細胞減少ECM的能力被證明有助于腫瘤T細胞浸潤，并最終提高抗癌效力。然而，由于它們的納米級大小，CAR-T細胞產生的外泌體可以用作直接的癌癥吸引劑，這可能有助于CAR介導的抗癌療法。從CAR-T細胞產生的外泌體必須能夠作為直接攻擊者，并且能夠針對特定的抗原靶向腫瘤位置，以替代抗癌療法中的CAR-T細胞。與需要治療性細胞主動移動到目標部位的基于細胞的療法不同，無細胞外泌體可以通過生物液體如血液循環傳遞。外泌體能夠穿越生物屏障，包括腫瘤血液屏障（BTB）和血腦屏障（BBB）。這一事實得到了支持，即在體液中發現了源自腫瘤細胞的外泌體。此外，靜脈注射的外泌體被腫瘤的高度保留效應和滲漏的血管系統推向腫瘤。據報道，外泌體在體內被動傳輸，但它們的目標導向分布主要受其表面組織特異性受體的影響，這些受體源自親代細胞。外泌體可以通過將內容物轉移到目標細胞來殺死癌細胞。這可以通過三種不同的機制發生。首先，通過直接接觸，外泌體可以與目標細胞表面的特定受體結合，觸發促進細胞死亡的信號級聯。這種相互作用可以激活誘導凋亡的途徑或刺激針對腫瘤細胞的免疫反應。其次，外泌體可以與目標細胞的質膜融合，導致生物活性分子（如蛋白質和核酸）轉移到細胞質中。這些轉移的組分可以破壞細胞內穩態，啟動凋亡途徑或干擾關鍵的細胞過程。最后，外泌體可以通過內吞作用被目標細胞內化，允許其貨物釋放到細胞內空間。外泌體的內容物，包括蛋白質、脂質和核酸，然后可以發揮細胞毒性作用，觸發程序性細胞死亡或調節細胞功能。這三種機制共同展示了外泌體如何有效地介導殺死腫瘤細胞并促進抗癌反應。

4.3.靶向特異性

CAR結構中的抗體衍生的單鏈可變片段（scFv）控制CAR-T細胞的靶向特異性。靶向攻擊屬性依賴于CD19特異性scFv在使用CD19-CAR-T細胞治療CD19陽性血液系統惡性腫瘤的治療方法中。正常器官或組織中也表達相同的抗原，這就是所謂的“靶向腫瘤外”的影響。細胞膜蛋白，如參與細胞靶向的蛋白，可能在生物發生過程中被運輸到外泌體。根據Muntasell等人的研究，在24小時內，B細胞表面結合的肽-MHC II復合物中有12%被內吞、運輸到多泡體，并在外泌體上釋放。

親代細胞的外泌體很可能能夠傳遞靶向特性。許多臨床前研究支持了這一觀點，盡管對CAR-T細胞制造的外泌體還需要更多的研究。Alvarez-Erviti等人在他們的研究中提供了針對性外泌體的直接證據。他們通過基因修飾樹突狀細胞表達Lamp2b，這是一種與神經元特異性狂犬病病毒糖蛋白（RVG）肽段相關的外泌體膜蛋白，成功制備了針對小鼠大腦的外泌體。然后他們使用這些外泌體作為向大腦輸送siRNA的遞送系統。RVG的可用性，作為一種配體，精確地與神經元中的乙酰膽堿受體結合，決定了它們在系統遞送后如何精確地分布到神經元。由于間充質干細胞（MSCs）對原發和轉移腫瘤部位的偏好，MSC介導的抗癌方法成為廣泛研究的主題。與細胞對應物相比，CAR-T外泌體提供了幾個有希望的優勢，包括高靶向特異性、對PD-L1免疫抑制不敏感，以及降低誘發細胞因子釋放綜合征的風險。來自靶向間皮素（MSLN）的CAR-T細胞的外泌體也觀察到了類似的鼓舞人心的結果。這些外泌體通過分泌穿孔素和顆粒酶B，有效地靶向MSLN陽性和三陰性乳腺癌細胞，展示了它們的效率。重要的是，在BT-549和MDA231-MSLN異種移植乳腺癌腫瘤模型中進行的體內研究表明，具有低毒性的顯著抗腫瘤效果。這些發現強調了CAR-T外泌體作為一種有前途的癌癥治療方法的潛力。

腫瘤衍生的生物因子和MSCs中匹配受體的存在是MSCs能夠進行腫瘤定向歸巢的必要條件。腫瘤通常被描述為“永不愈合的傷口”，因為它們是細胞因子、趨化因子和其他炎癥介質的持續來源。然而，MSCs表達多種生長因子的受體，如PDGF和IGF-1，以及趨化因子受體，包括CCR2、CCR3、CCR4和CCL5[101]。值得注意的是，所有表面標志物、信號分子和細胞粘附分子也存在于MSC衍生的外泌體中，這表明外泌體可能采用親代細胞的歸巢模式，并獲得與其親代細胞相同的一系列表面受體和相關結合蛋白。

這種天然的趨向性表明，選擇理想的細胞來源進行器官特異性治療方法的外泌體衍生是至關重要的。然而，工程化的CARs可以提供非HLA限制的細胞表面成分識別，并不依賴于HLA進行抗原處理和呈遞。因此，CAR-T更廣泛地適用于具有多樣化HLA的患者群體。

4.4.適應癌癥的復雜性和變化

除了賦予CAR-T細胞抗原特異性靶向能力外，工程化的CARs還增強了CAR-T細胞的生長和細胞因子產生。細胞因子是最直接的攻擊者，在CAR-T細胞內（主要是白細胞介素，如IL-2、IL-7、IL-15或IL-21）顯著擴大。然而，由于癌組織極度異質，癌細胞高度適應，這是藥物抗性的基礎，沒有特定的攻擊者或藥物能夠有效治療任何特定的癌癥。在藥物治療開始之前，幾乎所有癌癥病例中近50%存在對化療的內在抗性，而在剩余的50%癌癥病例中，獲得性抗性發生在相當一部分中。由于癌細胞的巨大異質性和復雜生物學特性，表現出廣泛的個體變異，迄今為止所有克服化療抗性的嘗試都失敗了。這可能是CD19-CAR-T細胞療法在CD19+B細胞白血病患者中成功有限的原因。理想的抗癌策略應該是多樣化的，并能夠同時采取行動，考慮到癌癥的異質性和可變性。抗癌藥物也可以根據患者的獨特情況進行調整。事實上，CAR-T細胞和CAR-T細胞衍生的外泌體提供了執行上述修改的有利平臺。

通過CAR-T細胞，可以間接添加額外的抗癌藥物。外泌體通過從親代細胞向受體細胞運輸各種信息，包括蛋白質、mRNAs、ncRNAs和miRNAs，作為細胞間通信的手段。外泌體和親代細胞都含有絕大多數的蛋白質、mRNAs和miRNAs。細胞外蛋白酶和RNases防止外泌體攜帶的蛋白質和RNAs降解，延長它們的半衰期，并增強它們的生物活性。根據小鼠的臨床前研究，從用腫瘤肽脈沖的DCs中分離出的外泌體能夠在體內啟動特定的細胞毒性T淋巴細胞，并以T細胞依賴的方式抑制已建立的小鼠腫瘤的生長，展示了從親代細胞到外泌體的刺激誘導信號轉移的操縱。以前已經顯示，當HepG2（肝癌細胞）和ASPC-1（胰腺癌細胞）暴露于用抗癌基因TRAIL工程化的MSCs的條件培養基（CM）時，它們具有顯著的細胞毒性。

由MSCs產生的外泌體可能在將抗癌劑從MSCs運輸到癌細胞中起著至關重要的作用。因為TRAIL表達載體被用于這種抗癌基因工程，TRAIL通過外泌體的遞送可能以cDNA、mRNA或蛋白質的形式進行。研究表明，使用心肌梗死模型，體外培養的基因修飾MSCs的CM在預防心室重塑方面的效果與細胞移植相當。一個或多個癌細胞攻擊者可能在體外擴增的CAR-T細胞中外泌體的生物合成過程中被間接加載。之后，根據患者的治療情況，可以替換多個和額外的攻擊者，當與內在的T淋巴細胞細胞因子結合時。

此外，抗癌藥物可以直接裝載到由CAR-T細胞制成的外泌體中。外泌體可能包含親水性和疏水性物質，因為它們類似于脂質體，也具有水核心和雙脂膜。對于像mRNA、siRNA和miRNA這樣的親水性分子，可以通過短暫的物理（例如，電穿孔）或化學（例如，脂質體介導）破壞外泌體膜來實現外泌體裝載。在Alvarez-Erviti等人的研究中，通過電穿孔將外源siRNA直接裝載到樹突狀細胞衍生的外泌體中，這導致了目標細胞中目標基因的mRNA和蛋白表達顯著下調。然而，短暫的直接共孵育可以使外泌體裝載疏水性分子。

通過外泌體傳遞的抗癌基因產物更容易使用，因為它們充當納米載體。P53、Myc和磷酸酶及張力蛋白同源物（PTEN）是大多數抗癌基因產物影響腫瘤細胞的細胞內機制的例子。在間充質干細胞（MSC）介導的基因治療領域，MSC被用作傳遞抗癌基因的載體。細胞內的抗癌基因產物需要在MSC中產生并分泌到細胞外空間，然后它們需要穿透附近的腫瘤細胞，通過生物膜，這是大多數大分子的自然屏障，包括肽和蛋白質。因此，相關表達載體的構建通常包含一個前導序列和一個轉錄激活因子（TAT）。然而，外泌體已被證明可以穿過血漿膜以將貨物傳遞給受體細胞。例如，來自樹突狀細胞的外泌體可以將裝載有肽段的MHC I和II復合體傳遞給其他樹突狀細胞和CD4+T細胞以控制免疫反應。來自親本細胞的mRNA和蛋白質可以直接轉移到受體細胞的細胞質中，避免了生物膜。從理論上講，通過外泌體生物發生，基因工程化的MSC可以以所有可能的形式傳遞抗癌基因產物，包括cDNA、mRNA和蛋白質。這可能解釋了分泌TRAIL和非分泌TRAIL的工程化MSC誘導的癌細胞死亡之間缺乏區別。顯然，外泌體將擴展和改善基于細胞的基因治療在癌癥治療中的應用，正確應用的話。CAR T細胞衍生的外泌體對腫瘤細胞的一些治療潛力在表2中總結。

5.結論

利用經過基因改造表達CAR的T淋巴細胞，基于CAR的過繼性免疫療法可以引發既是T細胞介導的，又是針對目標抗原的特異性免疫反應。輸注到體內后，CAR-T細胞作為“活藥”持續對預期的惡性細胞發起細胞毒性攻擊。它們自己的壽命和體內未來的擴展決定了它們強大的腫瘤殺傷能力將持續多久。然而，不可能充分控制CAR-T細胞釋放的細胞因子量或這些細胞的體內擴展狀態，這是CRS、細胞因子風暴和“靶向腫瘤外”反應等不良事件的潛在來源。

由CAR-T細胞制成的外泌體具有巨大的治療潛力，因為它們可以取代CAR-T細胞，瞄準腫瘤細胞。外泌體可以作為癌癥治療的直接對手，取代CAR-T細胞，由于它們的無細胞性質和生物學特性，具有明顯的優勢。首先，使用外泌體作為“現成”試劑使CRS可控。外泌體的適當使用也為CAR-T技術治療實體瘤鋪平了道路，包括由于它們的納米尺寸而針對特定區域的腫瘤，如膠質母細胞瘤。第三，除了CAR-T細胞的內在細胞因子外，還可以向CAR-T細胞衍生的外泌體中添加額外的攻擊者以防止潛在的抗藥性，第四，這兩種平臺（即CAR-T細胞和CAR-T細胞衍生的外泌體）的聯合和/或交替使用無疑將加強基于CAR的癌癥治療的應用。

根據圖3所示的在臨床環境中使用CAR-T細胞衍生的外泌體的提出方法，收集癌癥患者的外周血T細胞，將CAR通過病毒或非病毒方式插入T細胞，體外擴展CAR工程化的T細胞，分離外泌體，然后給患者外泌體。基于外泌體的獨特特性，如大小（30-150納米）、密度（1.1-1.18 g/ml）和進化上保守的蛋白質分子集合（CD9、CD63、CD81、Alix和Tsg101），可以從培養基中使用多種技術分離CAR-T細胞衍生的外泌體，包括超濾、超速離心和抗體偶聯磁珠上的親和捕獲。

圖3 目標識別的進展、提高腫瘤穿透性、毒性管理以及研究聯合療法為CAR-T細胞療法成功應用于實體瘤提供了樂觀的前景。這些進步使我們更接近于個性化和精準的癌癥治療。收集癌癥患者的外周血樣本以分離總的有核細胞。然后，在存在T細胞刺激因子（如CD3和CD28抗體）的條件下培養這些細胞。通過病毒或非病毒轉染技術引入嵌合抗原受體（CARs）對選定的CD8+T細胞進行遺傳修飾。進一步擴展CAR工程化的T細胞。從CAR-T細胞中分離出外泌體。最后，在化療預處理后，將分離出的外泌體重新輸回同一患者體內。

在使用CAR-T細胞衍生的外泌體進行任何臨床設置之前，確實有必要進行臨床前研究以對它們進行表征。總之，一種有希望的癌癥治療方法是基于CAR的T細胞過繼性免疫療法。作為一種前沿且有效的治療方法，由于癌癥的復雜性和不穩定性，它正遇到一些缺陷或限制。從CAR-T細胞衍生的外泌體可能取代CAR-T細胞，作為終極攻擊者，作為這種有效方式的延伸，從而克服當前治療模型中的一些缺點。通過適當整合細胞和外泌體平臺，這種有效的治療方法將變得更加功能強大，并應使我們更接近于創造一種新的針對性癌癥治療選擇。

此外，作為未來發展，我們可以參考選擇性地裝載所需的mRNA或控制目標基因裝載在外泌體中。最近的研究提出了選擇性裝載mRNA或控制目標基因裝載到外泌體中的策略。這包括工程化供體細胞、修改外泌體表面和使用合成納米顆粒。未來的進展旨在增強特定轉錄物的靶向和整合，提高穩定性，并優化裝載效率。創新的基因遞送系統和識別外泌體和受體細胞上的具體標記可以實現精確的貨物遞送。這些發展為精準醫療和基因治療等治療應用帶來了希望。