腦-心膽堿能突觸-鈣信號傳導介導缺血性卒中誘發(fā)房顫的機制研究
神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)聯(lián)系緊密，全球超 150 萬人因神經(jīng)心源性機制死亡，其中卒中后的心血管并發(fā)癥較為常見。房顫（atrial fibrillation, AF）在急性缺血性卒中患者中更常見，卒中后檢測到的房顫可能由多種原因引起，理解其潛在機制至關重要。卒中引起房顫的實驗動物模型仍然缺乏，阻礙了該卒中-心臟綜合征（Stroke-heart syndrome; SHS）作用機制的發(fā)現(xiàn)和針對性治療方法的開發(fā)。
基于此，天津中醫(yī)藥大學朱彥教授團隊聯(lián)合河南省醫(yī)學科學院電生理研究所郝國梁博士團隊在Theranostics 雜志上發(fā)表了"Brain-to-heart cholinergic synapse-calcium signaling mediates ischemic stroke-induced atrial fibrillation"相關文章。
文中建立缺血性腦卒中導致的房顫大鼠模型，揭示膽堿能受體介導的鈣信號通路異常是 SHS 的關鍵發(fā)病機制，并發(fā)現(xiàn)抗心律失常復方中藥穩(wěn)心顆粒可有效逆轉該綜合征的發(fā)生，為腦心綜合征的基礎研究和治療方法提出了新的思路。
研究方法：
本文采用熒光標測技術（Optical Mapping）來檢測不同模型組的動作電位及鈣瞬變信號，包括動作電位持續(xù)時間、鈣瞬變持續(xù)時間、傳導異質性和空間不一致的交替等電生理特性，同時采用單細胞鈣成像技術檢測單個心肌細胞 RyR2 和 SERCA 的功能，并評估穩(wěn)心顆粒的治療效果。
研究結果：
1. 缺血性卒中引起的竇性心律不齊可被穩(wěn)心顆粒（WK）抑制
通過 TTC 染色腦切片評估腦梗死，大腦中動脈閉塞（MCAO）后模型組梗死體積增加。缺血后大鼠用不同劑量 WK 或美托洛爾治療，腦缺血引起心律失常可被二者劑量依賴地抑制。S1S1 高強度頻率刺激使模型組大鼠房速 (AT) /房顫 (AF)更頻繁、AERP/APD 降低，WK 和美托洛爾可抗心律失常。在 S1S1 起搏中，模型組竇房結恢復時間長、易發(fā)生竇性心律不齊及 AF/AT，WK 和美托洛爾可減短竇房結恢復時間。（圖1）
圖1. 缺血性卒中引起的竇性心律不齊可被 WK 抑制
在竇性心律下，腦缺血使一系列動作電位指標發(fā)生顯著變化，包括動作電位傳導時間、 APD90 延長等，而 WK 不同劑量組或美托洛爾治療可改善這些變化。使用 6 Hz 刺激來校正由于竇性心律差異引起的傳導差異，6 Hz 刺激顯示腦缺血引起 APD90 延長等可被 WK 或美托洛爾抑制。當周期持續(xù)時間（S1S1 為 100-50 ms）縮短時房顫易發(fā)生，模型組動作電位交替空間不一致性突出，而 WK 低、中、高劑量組及美托洛爾組可在一定程度上抑制這種不一致性。（圖2）
圖2. 通過離體光學標測得到的缺血性卒中誘導的房顫（ISIAF）在 WK 治療前后的動作電位持續(xù)時間（APD）和鈣瞬變持續(xù)時間（CaT）變化
3. 缺血性卒中引起的鈣瞬變（CaT）改變可被穩(wěn)心顆粒（WK）恢復
鈣瞬變受細胞內(nèi)鈣信號調節(jié)，在竇性心律中，缺血性卒中鈣瞬變發(fā)生變化，包括 CaT90 延長等，而 WK 不同劑量組及美托洛爾可改善這些變化。6 Hz 刺激條件下顯示腦缺血引起的 CaT90 延長等可被穩(wěn)心顆粒或美托洛爾改善。通過縮短周期長度誘導心房交替變化，模型組的 CaT 交替變化比率在特定時間段高于假手術組，而 WK 不同劑量組及美托洛爾可部分減輕這種交替變化比率。（圖2）
通過不同方法展示鈣瞬變恢復過程，發(fā)現(xiàn) ISIAF 大鼠心臟鈣瞬變恢復曲線陡度增加及衰減時間常數(shù)增加，WK 和美托洛爾可改善，單細胞鈣成像和缺血性卒中大鼠實驗進一步支持 ISIAF 大鼠模型有效及穩(wěn)心顆粒的作用。（圖3）
圖3. 展示在有或沒有穩(wěn)心顆粒治療的缺血性卒中誘導的房顫模型中，與房顫相關的變化以及鈣釋放的恢復情況
4. 篩選出由缺血性卒中誘導的房顫 (ISIAF) 改變且能被穩(wěn)心顆粒恢復的心房基因
對假手術組、模型組和 WK 治療組大鼠心房組織進行 RNA-seq 分析。確定了受 WK 調節(jié)的基因，表明離子通道等相關過程重要，膽堿能突觸信號通路在受 WK 影響的經(jīng)典通路中排第一，圖10 展示了部分基因變化值及 WK 改善 ISIAF 的機制示意圖。
圖4. ISIAF 及 WK 治療下大鼠心房的轉錄組測序和 IPA 分析
圖10. 膽堿能和鈣信號通路在 ISIAF 及 WK 治療在神經(jīng)元和非神經(jīng)元（心臟）系統(tǒng)中的作用示意圖
由 ISIAF 上調的基因（CHAT、SLC5A7、AChE、CACNB1、ATP2A3 和 CHRM3）用紅色箭頭表示
被 WK 下調的基因（CHAT、SLC5A7、AChE、CACNB1、ATP2A3 和 CHRM3）用藍色條紋標記
5. WK 對 ICa-L 的影響
根據(jù)圖5 所示，WK 極大地抑制 L 型鈣電流峰值。不同濃度的 WK 對 ICa-L 有影響，濃度升高時，ICa-L 逐漸被抑制，且有最大半抑制濃度。WK 對穩(wěn)態(tài)激活電壓和 ICa-L 失活有影響，使激活和失活的值都有發(fā)生變化。在特定條件下，注入含 WK 的細胞外液后，ICa-L 激活的峰值電流密度降低，I-V 曲線向上移動但部分電位和曲線形狀未變。
圖5. WK 對 L 型鈣離子通道動力學調節(jié)的驗證
6. 篩選出與 CACNB1 和 CHRM3 相互作用的穩(wěn)心顆粒（WK）活性成分
為檢測 WK 進入大鼠血漿的活性成分，分析不同樣本，確定 WK 有 40 種化學成分及 21 種入血成分。通過分子對接篩選出與 CACNB1 和 CHRM3 高親和力的前 5 種化合物，并用模型描繪其關系，還指出部分入血成分情況。
圖6. 大鼠血漿中 WK 活性成分的化學圖譜
圖7. 通過分子對接針對毒蕈堿型乙酰膽堿受體 M3（CHRM3）和鈣電壓門控通道輔助亞基 β1（CACNB1）的 WK 活性化合物的虛擬篩選
8. WK 的活性化合物對 L 型鈣電流（ICa-L）的影響人參皂苷 Rb1、人參皂苷 Re、人參皂苷 Rg1、白術內(nèi)酯 Ⅱ、丹參酮 ⅡA、隱丹參酮和甘松新酮（濃度為 10、50 和 100 µmol/L)）對 ICa - L 無明顯抑制作用。而隨著薯蕷皂苷濃度（1、3、10、30 µmol/L)）升高，ICa - L 逐漸受到限制，薯蕷皂苷以濃度依賴的方式降低 ICa - L，其最大半抑制濃度（IC50）為 8.666±0.777 µmol/L)，在不同濃度下薯蕷皂苷可劑量依賴性地降低 ICa - L。
圖8. WK 活性化合物對大鼠心房肌細胞 ICa-L 的影響
9. WK 及其活性化合物對乙酰膽堿（Ach）激活的 HL-1 細胞的影響
HL-1 細胞研究表明，薯蕷皂苷濃度高于 100 µmol/L 時降低細胞活力，且能降低乙酰膽堿激活的 HL-1 細胞中 CHRM3 表達，1mg/mL WK 和 1 µmol/L 薯蕷皂苷作用與 CHRM3 抑制劑相似。
圖9. WK 活性化合物對 HL-1 細胞中毒蕈堿型乙酰膽堿受體 M3（CHRM3）激活的影響
研究結論：
該研究首次建立了缺血性卒中誘導的房顫（ISIAF）大鼠模型，并描述了腦缺血后心房電生理變化。分子機制分析表明，膽堿能突觸和鈣信號通路在這種腦心綜合征中起著核心作用。值得注意的是，通過使用復方中藥穩(wěn)心顆粒治療，ISIAF 可部分逆轉，穩(wěn)心顆粒通過調節(jié)相同的膽堿能突觸 - 鈣信號通路發(fā)揮作用。其活性成分之一薯蕷皂苷通過與 IKM3 結合并抑制 ICa-L 直接發(fā)揮作用。
本文章天津中醫(yī)藥大學朱彥教授和河南省醫(yī)學科學院電生理研究所所長郝國梁為共同通訊作者，天津中醫(yī)藥大學2021級博士研究生梁英然和河南省醫(yī)學科學院電生理研究所副所長王功新為文章的并列第一作者。
原文鏈接：
Brain-to-heart cholinergic synapse-calcium signaling mediates ischemic stroke-induced atrial fibrillation (thno.org)
