實驗原理牙膏檢樣經過處理，在一定條件下（如培養基、培養溫度、培養時間、pH值、需氧性質等）培養后，1 g檢樣中形成的微生物菌落總數。所得結果包括本方法規定的條件下生長的嗜中溫需氧菌和兼性厭氧菌的菌落總數。測定菌落總數便于判明樣品被細菌污染的程度，是對樣品進行衛生學總評價的綜合依據。
 
二、實驗準備
1、儀器和設備
①  自動菌落計數儀SHASHIN KAGAKU，PSF-1100。
②  三角瓶：250 mL。
③  量筒：200 mL。
④  pH計或精密pH試紙
⑤  試管：18 mm×150 mm。
⑥  滅菌平皿：fluidot  FDT-9CM-2-S，直徑90 mm。
⑦  無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）FDT-SP01001
⑧  無菌吸管：10 mL（具0.1 mL刻度）FDT-SP01010
⑨  手動移液器：fluidot  1 mL  MSP1K
⑩  電動移液器：pipetty  1 mL  MSIC01-02-1000
⑪  吸頭：1.5mL   FDT-1500-1-TSF
⑫  酒精燈。
⑬  恒溫培養箱：36℃±1℃。
⑭  恒溫水浴箱。
⑮  高壓滅菌器。
⑯  蠕動泵分液器：fluidot  600D
⑰  自動液體分裝儀：fluidot  30001-PP
2、培養基和試劑
① SCDLP液體培養基
② 卵磷脂、吐溫80—營養瓊脂培養基
制法：先將卵磷脂加到少量蒸餾水中，加熱溶解，加入吐溫80，將其他成分（除瓊脂外）加到其余的蒸餾水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐溫80，混勻，調pH值為7.1~7.4，加入瓊脂，121℃高壓滅菌20 min，儲存于冷暗處備用。
③ 0.5%氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyl terazolium chloride，TTC）
制法：溶解后過濾除菌，或115℃高壓滅菌20 min，裝于棕色試劑瓶，置4℃冰箱備用。
  
三、實驗步驟
1、用滅菌吸管吸取1:10的檢液2 mL，分別注入到兩個滅菌平皿內，每皿1 mL。另取1 mL注入到9 mL SCDLP液體培養基（或經過驗證等效或優于SCDLP的稀釋液）試管中（注意勿使吸管接觸液面），并充分混勻，制成1:100檢液，更換一支吸管，吸取2 mL，分別注入到兩個滅菌平皿內，每皿1 mL。樣品至少需進行1:10和1:100稀釋，如樣品含菌量高，還可再稀釋成1:1000，1:10000，……等，每個稀釋度應換1支吸管。
2、將融化并冷至45℃~50℃的卵磷脂吐溫80營養瓊脂培養基傾注到平皿內，每皿約15 mL，隨即轉動平皿，使檢液與培養基充分混合均勻，待瓊脂凝固后，翻轉平皿，置36℃±1℃培養箱內培養48 h±2 h。同時吸取1 mL空白稀釋液加入滅菌空平皿中，加入約15 mL卵磷脂吐溫80營養瓊脂培養基，待瓊脂凝固后，翻轉平皿，置36℃±1℃培養箱內培養48 h±2 h，為空白對照。
3、為便于區別牙膏中的顆粒與菌落，可在每100 mL卵磷脂吐溫80營養瓊脂中加入1 mL 0.5%的TTC溶液，如有細菌存在，培養后菌落呈紅色，而牙膏的顆粒顏色無變化。
 

• 菌落計數方法

1、在自動菌落計數儀上按照表一的數值，設置好條件。
2、使用自動菌落計數儀，快速識別重疊或模糊的菌落，1-3秒出結果后保存，繼續識別其它的培養皿，直到所有培養皿計算完畢。
 
 

• 菌落計數及報告方法

1、首先選取平均菌落數在30~300之間的平皿，作為菌落總數測定的范圍。當只有一個稀釋度的平均菌落數符合此范圍時，即以該平皿菌落數乘其稀釋倍數報告之（見表1中例1）。
2、若有兩個稀釋度，其平均菌落數均在30~300之間， 則應求出兩菌落總數之比值來決定，若其比值小于或等于2，應報告其平均數，若大于2則以其中稀釋度較低的平皿的菌落數報告之（見表1中例2及例3）。
3、若所有稀釋度的平均菌落數均大于300，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（見表1中例4）。
4、若所有稀釋度的平均菌落數均小于30，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（見表1例5）。
5、若所有稀釋度的平均菌落數均不在30~300之間，其中一個稀釋度大于300，而相鄰的另一稀釋度小于30時，則以接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（見表1中例6）。
6、若所有的稀釋度均無菌生長，報告數為每g小于10 CFU。
7、菌落計數的報告，菌落數在10以內時，按實有數值報告之，大于100時，采用二位有效數字，在二位有效數字后面的數值，應以四舍五入法計算。為了縮短數字后面零的個數，可用10的指數來表示（見表1報告方式欄）。在報告菌落數為“不可計”時，應注明樣品的稀釋度。
 
表1  細菌計數結果及報告方式

例次	不同稀釋度平均菌落數 10-1     10-2     10-3	兩稀釋度 菌數之比	菌落總數 （CFU/g）	報告方式 （CFU/g）
1	1365    164     20	─	16400	16000或1.6×104
2	2760    295     46	1.6	38000	38000或3.8×104
3	2890    271     60	2.2	27100	27000或2.7×104
4	不可計  4650    513	─	513000	510000或5.1×105
5	27      11      5	─	270	270或2.7×102
6	不可計  305     12	─	30500	31000或3.1×104
7	0       0       0	─	＜1×10	＜10

注：CFU-菌落形成單位。
8、以CFU/g 為單位報告。