探究 RNA 轉染實驗效率低下的緣由
一、引言
二、影響 RNA 轉染效率的因素分析
（一）RNA 質量與結構
- RNA 純度
- RNA 樣本中若含有蛋白質、DNA、有機溶劑等雜質，會顯著影響轉染效率。例如，蛋白質雜質可能與 RNA 競爭轉染試劑的結合位點，從而減少有效轉染復合物的形成；DNA 雜質則可能干擾 RNA 與細胞內受體的相互作用，導致轉染過程受阻。
- 檢測方法：通過紫外分光光度計測定 RNA 在 260nm、280nm 和 230nm 處的吸光值，計算 A260/A280 和 A260/A230 比值。純凈的 RNA 樣品，A260/A280 比值應在 1.8 - 2.0 之間，A260/A230 比值應大于 2.0。若比值偏離正常范圍，提示 RNA 可能存在雜質污染。
- RNA 完整性
- 降解的 RNA 分子結構不完整，無法有效參與轉染過程中的一系列生物化學反應，導致轉染效率降低。RNA 在提取、保存和處理過程中容易受到核糖核酸酶（RNase）的降解。
- 檢測方法：采用瓊脂糖凝膠電泳分析 RNA 的完整性。完整的 RNA 在凝膠上會呈現出清晰的 28S、18S 和 5S 核糖體 RNA 條帶，且 28S 條帶的亮度應約為 18S 條帶的兩倍。若出現條帶模糊、拖尾或缺失等現象，則表明 RNA 可能已發生降解。
- RNA 二級結構
- RNA 分子具有復雜的二級和三級結構，某些特定的二級結構可能會阻礙轉染試劑與 RNA 的結合，或者影響 RNA 進入細胞后的解旋和釋放過程，從而降低轉染效率。
- 預測方法：利用生物信息學軟件如 RNAfold 等對 RNA 序列進行二級結構預測。分析預測結果中是否存在可能影響轉染的穩定二級結構，如莖環結構、發夾結構等。對于具有復雜二級結構的 RNA，可以嘗試通過優化實驗條件（如提高轉染溫度、使用特殊的轉染試劑等）或對 RNA 進行適當的預處理（如熱變性等）來降低其對轉染效率的影響。
（二）轉染試劑特性
- 轉染試劑類型
- 不同類型的轉染試劑其轉染原理和適用范圍各不相同，對 RNA 轉染效率的影響也存在差異。例如，陽離子脂質體轉染試劑通過靜電作用與帶負電的 RNA 結合形成復合物，然后通過內吞作用進入細胞；而聚合物轉染試劑則依靠其與 RNA 形成的納米顆粒來實現細胞攝取。某些轉染試劑可能對特定類型的細胞或 RNA 具有更高的轉染效率。
- 選擇策略：在進行 RNA 轉染實驗前，需要充分了解不同轉染試劑的特點和適用范圍，并根據實驗目的、細胞類型以及 RNA 的性質等因素進行合理選擇。同時，可以參考相關文獻或進行預實驗，比較不同轉染試劑在相同實驗條件下的轉染效率，以確定最適合的轉染試劑。
- 轉染試劑毒性
- 轉染試劑在促進 RNA 進入細胞的過程中，可能對細胞產生一定的毒性作用，影響細胞的正常生理功能和存活狀態，進而導致轉染效率下降。高毒性的轉染試劑會引起細胞凋亡、形態改變、代謝紊亂等不良反應，降低細胞對 RNA 的攝取和處理能力。
- 評估方法：通過細胞活力檢測實驗如 MTT 法、CCK - 8 法等評估轉染試劑對細胞的毒性。在轉染實驗過程中，設置不同濃度的轉染試劑處理組，同時設立未處理的對照組，在轉染后的特定時間點檢測細胞活力。選擇在保證較高轉染效率的前提下，對細胞毒性較小的轉染試劑濃度進行后續實驗。
- 轉染復合物穩定性
- 轉染試劑與 RNA 形成的復合物在細胞培養液中的穩定性對轉染效率至關重要。不穩定的復合物可能在進入細胞前就發生解離，導致 RNA 無法有效遞送到細胞內。復合物的穩定性受到多種因素的影響，如轉染試劑與 RNA 的比例、溶液的離子強度、pH 值等。
- 優化方法：在制備轉染復合物時，嚴格按照轉染試劑說明書的要求控制轉染試劑與 RNA 的比例。同時，注意優化轉染過程中的溶液條件，保持適當的離子強度和 pH 值。可以通過在不同條件下制備轉染復合物，并檢測其在一定時間內的穩定性（如通過動態光散射技術測量復合物粒徑的變化等），來確定最佳的轉染復合物制備條件。
（三）細胞因素
- 細胞類型
- 不同類型的細胞其細胞膜結構、表面受體表達、內吞途徑以及代謝活性等方面存在顯著差異，這些因素都會影響 RNA 的轉染效率。例如，一些貼壁細胞如 HeLa 細胞、HEK293 細胞等相對容易轉染，而某些原代細胞或懸浮細胞則轉染難度較大。
- 應對策略：針對不同類型的細胞，需要優化轉染條件。對于難轉染的細胞，可以嘗試采用特殊的轉染方法或轉染試劑，如電穿孔法、病毒載體介導的轉染等。此外，還可以通過對細胞進行預處理（如使用細胞松弛素 B 等藥物增加細胞膜的通透性）或共轉染一些輔助因子（如陽離子聚合物等增強細胞對 RNA 的攝取能力）來提高轉染效率。
- 細胞生長狀態
- 處于對數生長期的細胞具有較強的代謝活性和分裂能力，對 RNA 的攝取和處理能力也相對較高，因此轉染效率通常較高。而處于靜止期或老化狀態的細胞，其生理功能下降，轉染效率會受到明顯影響。
- 控制方法：在進行 RNA 轉染實驗前，確保細胞處于良好的生長狀態。定期傳代培養細胞，使細胞始終保持在對數生長期。通過細胞計數和顯微鏡觀察等方法監測細胞的生長狀態，選擇合適的細胞密度進行轉染實驗。一般來說，細胞密度在轉染時應達到 70% - 90% 左右，但具體密度還需根據細胞類型和實驗要求進行調整。
- 細胞 passages 次數
- 隨著細胞傳代次數的增加，細胞可能會發生遺傳變異和表型改變，導致其轉染效率逐漸下降。此外，長期培養的細胞可能會積累一些細胞培養過程中的應激因素，影響細胞的正常功能和對 RNA 的響應能力。
- 注意事項：盡量使用低 passages 次數的細胞進行實驗。在細胞培養過程中，記錄細胞的傳代次數，并定期對細胞的轉染效率進行檢測。如果發現細胞轉染效率隨著 passages 次數的增加而明顯降低，應重新復蘇早期 passages 的細胞或從可靠的細胞庫獲取新的細胞株。
（四）實驗操作環境
- 無菌操作
- RNA 轉染實驗要求嚴格的無菌操作環境，以防止微生物污染對細胞和實驗結果的影響。微生物污染可能導致細胞生長異常、死亡或產生炎癥反應，從而干擾 RNA 轉染過程。例如，細菌或真菌產生的毒素可能影響細胞的膜通透性和代謝功能，降低轉染效率。
- 操作規范：在實驗過程中，所有涉及細胞培養和 RNA 處理的操作均應在無菌超凈工作臺內進行。使用無菌的培養器具和試劑，定期對超凈工作臺進行清潔和消毒。在操作前，對手部進行嚴格消毒，穿戴無菌手套和口罩。同時，注意避免將外界的微生物帶入實驗環境，如避免在操作過程中頻繁打開超凈工作臺的門等。
- 溫度和濕度
- 實驗環境的溫度和濕度對 RNA 轉染效率也有一定的影響。溫度過高或過低可能影響細胞的生理狀態和代謝活性，進而影響 RNA 的攝取和轉染效果。濕度不合適可能導致培養液蒸發過快或過慢，影響細胞的生長環境和轉染試劑的穩定性。
- 控制條件：一般來說，細胞培養和 RNA 轉染實驗應在 37°C、5% CO₂的培養箱中進行，培養箱內的濕度應保持在相對穩定的水平（通常為 95% 左右）。在實驗過程中，定期檢查培養箱的溫度和濕度參數，確保其符合實驗要求。如果實驗環境的溫度和濕度波動較大，可以考慮使用恒溫恒濕培養箱或在實驗室內安裝空調和除濕設備等進行調節。
- 震動和干擾
- 在 RNA 轉染過程中，細胞培養板或培養皿的震動以及外界的電磁干擾等因素可能會影響轉染復合物與細胞的結合和攝取過程，從而降低轉染效率。例如，劇烈的震動可能導致轉染復合物從細胞表面脫落，而電磁干擾可能影響細胞內的信號傳導和代謝過程，間接影響 RNA 轉染效果。
- 避免措施：在轉染過程中，盡量將細胞培養板或培養皿放置在平穩的實驗臺上，避免不必要的震動和移動。同時，將實驗設備遠離強電磁場源，如電機、變壓器等。在進行細胞培養和轉染操作時，創造一個安靜、穩定的實驗環境，以確保轉染實驗的順利進行。
三、結論與展望
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