熒光抗體（FA）技術的各種方法詳細解讀
免疫熒光染色一直是一種高度可靠和強大的技術，用于廣泛的研究和診斷目的。
通常，熒光抗體（FA）技術將涉及使用細胞或抗體，其恒定區域已用熒光標記標記（也稱為熒光團）標記。FA技術通常分為直接或間接。
一、直接熒光抗體
直接熒光抗體技術，也可以稱為直接免疫熒光（DIF），涉及使用單個熒光標記的一抗，用于與靶抗原結合。當臨床使用時，DIF對于快速診斷細菌性疾病特別有用，如化膿性鏈球菌（通常稱為鏈球菌）以及肺炎支原體和嗜肺軍團菌屬引起的肺炎。
出于這種診斷目的，首先將患者樣本放在顯微鏡載玻片上，然后暴露于熒光抗體中。熒光標記抗體和靶抗原（在這些情況下是細菌）之間的任何結合都會導致這些物質在用熒光顯微鏡檢查時發光。
除了用作診斷工具外，DIF還廣泛用于科學研究。為此，將切成5或6微米（μm）薄片的冷凍組織樣品放置在載玻片上。
然后將載玻片與熒光標記抗體一起孵育，熒光標記抗體通常包括一組針對IgA，IgG和IgM抗體同種型的抗體以及針對目標抗原的補體3。
請注意，用于此類研究的抗體濃度將基于先前的實驗，這些實驗已確認哪種濃度可以達到最高的信噪比。
在載玻片在黑暗和室溫下孵育至少30分鐘后，洗滌載玻片，然后用熒光顯微鏡成像。
二、間接熒光抗體
與用于DIF的單步技術相比，間接IF（IIF）或間接FA（IFA）是一個兩步過程，首先將未標記的一抗施加到針對靶抗原的樣品上。IIF的第二步涉及使用熒光標記的二抗，該二抗針對一抗的Fc部分。
盡管IIF被認為比DIF更復雜，因為它需要更長的時間才能完成并且需要使用兩種兼容的抗體，但它在靈敏度方面更勝一籌。
IFA測試的一些常見臨床應用包括用于診斷梅毒的測試。對于這種類型的IFA測試，先前從研究動物中分離出的T. Palladium細胞被分離并放置在載玻片的表面上。然后將從患者獲得的血清散布在鈀錐蟲細胞上，以允許抗密螺旋體抗體（如果存在）與固定抗原結合。
沖洗掉患者的血清樣本后，加入用熒光團標記的二抗。梅毒陽性結果將照亮所有二抗-熒光團偶聯物復合物。
另一種廣泛用于臨床環境的IFA是用于診斷系統性紅斑狼瘡（SLE）的IFA。SLE是一種自身免疫性疾病，其循環抗核自身抗體（ANA）水平將增加，這些抗體針對DNA和與DNA結合的各種蛋白質。
對于這種類型的IFA測試，將細胞培養，然后放置在載玻片上。然后將每張載玻片與不同濃度的患者抗體一起孵育，然后洗滌以去除任何未結合的蛋白質。在洗滌步驟之后，將熒光標記的二抗（用于ANA測試）添加到載玻片中并使其孵育。然后從顯示熒光的最高血清稀釋度中獲得血清中 ANA 的滴度，并用于確定 SLE 診斷。
三、流式細胞術
第三種類型的熒光抗體技術包括流式細胞術，這是一種自動細胞計數系統，可用于定量存在于復雜混合物（如血液或血清）中的特定細胞。
典型的流式細胞術實驗將從孵育熒光標記的抗體開始，該抗體針對特定的細胞亞群，例如抗CD4，其可以與各種免疫細胞表面發現的糖蛋白CD4結合，包括T輔助細胞，單核細胞和巨噬細胞。流式細胞術還可以通過使用適當的細胞制造商來量化多種細胞類型的存在。
孵育完成后，將樣品引入流式細胞儀。在這臺機器中，狹窄的毛細管迫使樣品中存在的細胞在單個文件中移動。當細胞穿過毛細管時，激光用于激活和激發任何已用熒光團標記的細胞。
然后通過正向和側向散射檢測器測量每個激發細胞的熒光強度，并將其描繪在直方圖上進行分析。除了定量目的外，流式細胞術和免疫熒光都可用于通過稱為熒光激活細胞分選儀（FACS）的技術將細胞分選為純化的亞群以進行研究。
通常，熒光抗體（FA）技術將涉及使用細胞或抗體，其恒定區域已用熒光標記標記（也稱為熒光團）標記。FA技術通常分為直接或間接。
一、直接熒光抗體
直接熒光抗體技術，也可以稱為直接免疫熒光（DIF），涉及使用單個熒光標記的一抗，用于與靶抗原結合。當臨床使用時，DIF對于快速診斷細菌性疾病特別有用，如化膿性鏈球菌（通常稱為鏈球菌）以及肺炎支原體和嗜肺軍團菌屬引起的肺炎。
出于這種診斷目的，首先將患者樣本放在顯微鏡載玻片上，然后暴露于熒光抗體中。熒光標記抗體和靶抗原（在這些情況下是細菌）之間的任何結合都會導致這些物質在用熒光顯微鏡檢查時發光。
除了用作診斷工具外，DIF還廣泛用于科學研究。為此，將切成5或6微米（μm）薄片的冷凍組織樣品放置在載玻片上。
然后將載玻片與熒光標記抗體一起孵育，熒光標記抗體通常包括一組針對IgA，IgG和IgM抗體同種型的抗體以及針對目標抗原的補體3。
請注意，用于此類研究的抗體濃度將基于先前的實驗，這些實驗已確認哪種濃度可以達到最高的信噪比。
在載玻片在黑暗和室溫下孵育至少30分鐘后，洗滌載玻片，然后用熒光顯微鏡成像。
二、間接熒光抗體
與用于DIF的單步技術相比，間接IF（IIF）或間接FA（IFA）是一個兩步過程，首先將未標記的一抗施加到針對靶抗原的樣品上。IIF的第二步涉及使用熒光標記的二抗，該二抗針對一抗的Fc部分。
盡管IIF被認為比DIF更復雜，因為它需要更長的時間才能完成并且需要使用兩種兼容的抗體，但它在靈敏度方面更勝一籌。
IFA測試的一些常見臨床應用包括用于診斷梅毒的測試。對于這種類型的IFA測試，先前從研究動物中分離出的T. Palladium細胞被分離并放置在載玻片的表面上。然后將從患者獲得的血清散布在鈀錐蟲細胞上，以允許抗密螺旋體抗體（如果存在）與固定抗原結合。
沖洗掉患者的血清樣本后，加入用熒光團標記的二抗。梅毒陽性結果將照亮所有二抗-熒光團偶聯物復合物。
另一種廣泛用于臨床環境的IFA是用于診斷系統性紅斑狼瘡（SLE）的IFA。SLE是一種自身免疫性疾病，其循環抗核自身抗體（ANA）水平將增加，這些抗體針對DNA和與DNA結合的各種蛋白質。
對于這種類型的IFA測試，將細胞培養，然后放置在載玻片上。然后將每張載玻片與不同濃度的患者抗體一起孵育，然后洗滌以去除任何未結合的蛋白質。在洗滌步驟之后，將熒光標記的二抗（用于ANA測試）添加到載玻片中并使其孵育。然后從顯示熒光的最高血清稀釋度中獲得血清中 ANA 的滴度，并用于確定 SLE 診斷。
三、流式細胞術
第三種類型的熒光抗體技術包括流式細胞術，這是一種自動細胞計數系統，可用于定量存在于復雜混合物（如血液或血清）中的特定細胞。
典型的流式細胞術實驗將從孵育熒光標記的抗體開始，該抗體針對特定的細胞亞群，例如抗CD4，其可以與各種免疫細胞表面發現的糖蛋白CD4結合，包括T輔助細胞，單核細胞和巨噬細胞。流式細胞術還可以通過使用適當的細胞制造商來量化多種細胞類型的存在。
孵育完成后，將樣品引入流式細胞儀。在這臺機器中，狹窄的毛細管迫使樣品中存在的細胞在單個文件中移動。當細胞穿過毛細管時，激光用于激活和激發任何已用熒光團標記的細胞。
然后通過正向和側向散射檢測器測量每個激發細胞的熒光強度，并將其描繪在直方圖上進行分析。除了定量目的外，流式細胞術和免疫熒光都可用于通過稱為熒光激活細胞分選儀（FACS）的技術將細胞分選為純化的亞群以進行研究。
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