光學顯微鏡是生物醫學研究必不可少的工具，其中雙光子顯微成像技術具有大深度三維顯微成像功能，被認為是深層生物組織研究的首選工具。

但是，在雙光子成像系統使用過程中，光學系統的裝配偏差、光學元件不理想以及生物樣品的不均勻性都會在成像過程中引入像差，從而降低成像質量。通過在雙光子顯微成像系統中引入自適應光學技術，可實現對像差的有效校正，從而提高成像的分辨率、深度和視場。

深圳的章辰、高玉峰團隊在《中國激光》發表文章，介紹了雙光子顯微成像中的像差來源和特點，概述了自適應光學技術中不同的探測和校正方法，綜述了近年來自適應光學技術在雙光子顯微成像中不同的應用成果，最后對自適應光學在雙光子顯微成像中的發展進行了展望。

雙光子顯微成像技術及其像差分析
雙光子顯微成像技術是基于雙光子效應實現的。在一般情況下，熒光分子會吸收一個高能量的光子，從基態躍遷至激發態，經過一段弛豫時間后回到基態，同時輻射出一個能量比激發光光子能量小但是波長更長的光子，這就是單光子效應。

然而，在高光子密度的條件下，熒光分子可同時吸收兩個能量較小、波長較長的光子，從基態躍遷至激發態，隨后在激發態弛豫一段時間后再回到基態，這時輻射出能量比激發光光子能量高但是小于兩個光子能量總和的光子，這就是雙光子效應。

雙光子顯微成像系統中的像差主要有兩個來源：一是由光學系統裝調和光學元件不理想引入的像差，稱之為系統像差；二是由生物樣品的折射率不均勻性引入的像差，稱之為樣品像差。

其中，系統像差通常為固定的低階像差，不隨時間變化，因此可以通過對光學系統的優化設計來減小像差，同時也可以預先測量、標定和補償像差。與系統像差相比，樣品像差除了大部分的低階像差以外，還包括更復雜的高階像差，這些像差通常會隨著成像深度的增加而增大。由于不同樣品或同一樣品不同區域的散射體大小和折射率不盡相同，不同樣品或同一樣品不同區域產生的像差也不一樣，因此樣品像差是無規律的、不可預測的，這也是雙光子顯微成像系統中最主要也是最難消除的像差。

雙光子顯微成像系統包含了激發光和發射光兩條光路，激發光在生物樣品上聚焦以激發熒光物質發出熒光。而生物樣品的折射率不均勻性會降低激發光的聚焦能力，進而影響熒光發射。因此在進行像差補償時，對激發光光路進行像差校正是必須的。對于發射光而言，通常采用光電倍增管（PMT）進行點探測成像，成像過程實際上是對熒光能量進行收集，發射光光路中的像差對成像質量的影響可忽略，因此無須對發射光光路進行像差校正。

自適應光學技術
在AO技術中，通常把波前探測方法分為兩類：一類是使用波前傳感器（WS）基于幾何光學原理對波前進行探測，稱之為直接波前探測；另一類是不使用波前傳感器，而是通過優化算法對一系列圖像進行計算，推導得出波前，稱之為間接波前探測。

間接波前探測
間接波前探測的概念最早來自1974年出現的像清晰化技術，但是隨著20世紀90年代后期硬件技術的革新和優化控制算法的更新，間接波前探測的應用才開始蓬勃發展起來。間接波前探測無需專門的波前傳感器，直接利用成像探測器獲得的光強信息建立像質評價函數，然后基于特定的優化算法在波前校正器上附加某些特定的相位，以尋找評價函數的極值，達到獲取最優信號強度的目的，當評價函數達到極值時認為畸變波前已得到了校正。間接波前探測又可細分為搜索算法和模式法兩大類。

直接波前探測
直接波前探測是通過波前探測器和波前重建算法來獲得畸變波前的相位分布，然后將相位信息反饋給波前校正器，波前校正器產生一個與畸變波前互補的補償波前，從而達到波前校正的目的。常用的波前探測器是夏克-哈特曼波前傳感器（SHWS），其工作原理是首先利用微透鏡陣列把畸變波前分割成多個小塊并聚焦到照相機的靶面上，通過照相機采集各個焦點的空間位置信息，然后計算各個焦點與微透鏡陣列理想中心點的偏移量，得到畸變波前的斜率分布，最后根據Zernike梯度多項式計算得到畸變波前的相位分布。

干涉測量技術
干涉測量技術是另一種非接觸、高精度的直接波前探測技術，目前在天文探測、光學元件精密制造、眼科治療等領域中得到廣泛應用。在干涉測量技術中，通常使用相移法使參考光與被測光之間產生穩定變化的相位差，通過多幅相位差圖像計算出兩束光波前的相位差信息，再根據干涉測量的具體工作原理，得到被測光路中的畸變波前相位分布。隨著科學技術的發展，干涉測量技術已從一種靜態測量技術發展為動態測量技術，其測量速度已使其可以用于活體成像。

波前校正方法
波前校正器是AO系統中進行像差校正的執行器件，通過改變入射光束不同位置的光程差來進行畸變波前的相位補償。波前的畸變在本質上是光程的差異，光程可表示為光在傳輸介質中經過的路程與傳輸介質折射率的乘積，因此可以通過改變光在傳輸介質中經過的路程或改變傳輸介質的折射率來對畸變波前進行補償。

因此，波前校正器可分為兩類：一類是通過改變傳輸介質折射率來實現相位補償的波前校正器，如液晶空間光調制器（SLM）；另一類是通過改變光在傳輸介質中經過的路程來進行相位補償的波前校正器，如變形鏡（DM）。

SLM進行相位調制是通過偏轉液晶面板上的雙折射液晶分子來實現的：在液晶面板的兩端施加不同的電壓，雙折射液晶分子隨著電壓的變化而產生不同的偏轉角度，使液晶面板的折射率發生變化，從而改變穿過液晶的光程，實現相位調制。此外，可以通過調制電壓獨立地改變SLM上每一個像素對應的液晶分子折射率，實現高空間分辨率的相位調制。但是，SLM具有偏振依賴性，入射光必須為線偏振光才能實現相位調制，大大降低了器件的光能利用率。因此，在雙光子顯微成像系統中，必須提高激發光的功率，才能保證SLM校正后的激發光能量足以激發熒光。

DM是通過改變反射鏡的表面形狀來改變DM反射的光程，從而實現相位補償。根據驅動器的不同，常用的DM有微機電系統（MEMS）變形鏡和壓電陶瓷變形鏡。MEMS變形鏡采用的是微機電技術，主要由鏡面層、電極層和基底層組成，反射鏡為反射率較高的鍍鋁或鍍銀薄膜，在給電極層上分布的各個電極施加不同的電壓后，鏡面層與電極層之間會產生電勢差，從而產生靜電力吸附薄膜，使反射鏡產生形變。壓電陶瓷變形鏡是通過改變壓電驅動器的控制電壓來實現驅動器的伸縮，進而帶動驅動器支撐的反射鏡產生形變。相比于SLM，DM的校正速度更快，也無偏振依賴性，但是DM的空間分辨率受驅動器個數的限制，且價格相對昂貴。

前沿應用
具有高成像分辨率及大成像深度和視場的顯微成像技術一直是雙光子顯微成像乃至整個顯微成像領域的研究熱點，其中AO技術在探測和校正像差中發揮了重要作用。自2000年AO技術首次被應用于雙光子顯微成像以來，不同探測方法和校正方法的成功應用使得具有大視場、高成像分辨率的深層生物組織活體成像成為可能。

間接波前探測方法在雙光子顯微成像中的應用
1.基于子孔徑分割的算法
Ji等提出基于子孔徑分割的間接波前探測算法，使用SLM調制波前相位，對小鼠大腦皮層切片產生的像差進行預校正，能達到近衍射極限的成像分辨率；Tang等提出二分迭代法的間接波前探測算法，提高了波前探測速度和成像分辨率，實現了活體小鼠大腦皮層神經元的成像；Wang等引入數字微鏡器件（DMD），縮短了校正時長，實現了活體小鼠大腦皮層神經元的成像；Rodríguez等設計了更緊湊的子孔徑探測模塊，實現了活體小鼠大腦皮層和脊髓中神經元的結構成像以及脊髓神經元中鈣離子的功能成像，在三光子顯微成像系統中進一步提升了成像深度；本課題組提出環形子孔徑分割算法，用于校正旋轉對稱像差，能達到近衍射極限的成像分辨率。

2.基于模式法的算法
Park等提出基于模式法的間接波前探測方法，實現了大視場像差校正；Streich等將基于模式法的無波前探測技術引入到三光子顯微成像系統中，增大了成像深度；研究團隊對視場進行子孔徑分割，提高了視場邊緣的成像分辨率，實現了大視場成像。

間接波前探測方法結構相對簡單，對成像對象無限制，易于實現，但波前校正過程計算量大、耗時長，很難滿足快速成像需求，測量精度低于直接波前探測。

直接波前探測方法在雙光子顯微成像中的應用
1.使用外源熒光物質作為引導星
Cha等、Tao等在樣品里注射外源熒光物質作為引導星，對離體小鼠大腦組織進行成像，提高了成像分辨率，但該方法會對樣品產生干擾且引導星空間位置難精確控制，未被廣泛使用。

2.使用雙光子激發的熒光作為引導星
Wang等認為雙光子激發的熒光可作為引導星，提出去掃描技術提高直接波前探測的質量和效率，使用SLM對激發光進行校正，對開顱活體小鼠大腦皮層神經元進行結構成像，將引導星改為近紅外熒光蛋白，對活體小鼠大腦皮層神經元中的鈣離子傳導進行功能成像，成像深度達700μm；Liu等將近紅外熒光染料作為引導星，將波前校正器換成DM，對小鼠大腦皮層中的微血管和神經元進行結構成像，成像深度可達1100μm，對神經元釋放谷氨酸和鈣離子的過程進行功能成像，提升了成像質量；Qin等將DM置于去掃描后的探測光路中，實現了對激發光的迭代校正，優化了波前重建算法和雙光子顯微成像系統中激發光的數值孔徑，降低了激發光的散射效應，增加了探測深度，通過與光透明技術結合，實現了小鼠顱骨完整狀態下大腦皮層神經元的成像，成像深度為700μm。

直接波前探測方法能夠得到畸變波前的客觀描述，測量速度更快、準確度更高，但系統結構復雜，會降低成像信噪比，波前探測器的靈敏度和探測精度也會受信噪比影響。

F-SHARP技術在雙光子顯微成像中的應用
1.技術原理
Papadopoulos等提出聚焦掃描全息像差探測（F-SHARP）方法，通過雙光束干涉直接測量畸變波前的點擴散函數（PSF），并使用測量得到的PSF相位的共軛來校正波前。

2.應用進展
Qin等在F-SHARP系統中將遠程聚焦方法與共軛AO相結合，使用鎖相放大器簡化PSF的測量步驟，提高了畸變波前的測量速度和準確度，將改進后的F-SHARP技術應用于三光子顯微成像系統中，實現了小鼠大腦皮層神經元的結構成像和海馬體的高分辨率成像。

3.技術特點
無需專門的波前傳感器，將發射光全部用于成像，保證了成像信噪比；使用雙光束干涉技術，部分激發光功率損失，但探測時間大幅縮短，與快速相移技術結合，探測速度進一步提升。

總結與展望
具有更大成像視場、更深成像深度和更高成像分辨率的雙光子顯微成像系統可為生物學和醫學研究提供更豐富、準確的影像信息，AO技術將在顯微成像領域發揮重要作用，為成像質量的突破提供技術支持。未來，加快畸變波前的探測和校正速度、提升校正的動態范圍是實現活體快速成像的必經之路，將各種探測、校正和控制技術有效結合，以及與其他技術融合，將是研究的重點。

聲明：本文僅用作學術目的。文章來源于:章辰, 高玉峰, 葉世蔚, 李慧, 鄭煒. 自適應光學在雙光子顯微成像技術中的應用[J]. 中國激光, 2023, 50(3): 0307103. Chen Zhang, Yufeng Gao, Shiwei Ye, Hui Li, Wei Zheng. Application of Adaptive Optics in Two‑photon Microscopic Imaging[J]. Chinese Journal of Lasers, 2023, 50(3): 0307103.