MeRIP-seq等揭示m6A甲基化及調控因子在食管胃結合部腺癌中的作用
食管胃結合部腺癌(adenocarcinoma of the esophagogastric junction，AEG)是一種在食管胃結合部發生的腺癌，其發病率在全球范圍內呈上升趨勢，但具體的發病機制尚不明確。盡管在基因組、轉錄組、蛋白質組和磷酸化蛋白質組水平上對大量AEG患者進行了深入研究，但AEG仍然缺乏有效的治療靶點和預后標志物。因此，理解AEG癌變的分子機制并識別潛在的預后標志物和治療靶點是至關重要的。N6-甲基腺苷（m6A）修飾及其調控因子在人類癌癥中發揮著關鍵作用，但它們在食管胃結合部腺癌（AEG）中的功能和調控機制仍不清楚。
2024年08月06日，廣東省人民醫院（廣東省醫學科學院）普外科李勇教授研究團隊和東南大學附屬中大醫院高山教授研究團隊合作在《Int J Biol Sci》雜志發表題為“m6A modification enhances the stability of CDC25A promotes tumorigenicity of esophagogastric junction adenocarcinoma via cell cycle“的研究論文，研究納入30名新診斷的AEG患者，收集其手術后的新鮮樣本后通過RNA-seq、RIP/meRIP-seq、 LACE-seq等分析揭示了m6A修飾增強CDC25A穩定性，進而通過細胞周期促進食管胃結合部腺癌（AEG）的致瘤性。
標題：m6A modification enhances the stability of CDC25A promotes tumorigenicity of esophagogastric junction adenocarcinoma via cell cycle（m6A修飾增強CDC25A穩定性，進而通過細胞周期促進AEG致瘤性）
期刊：International Journal of Biological Sciences（Int J Biol Sci）
影響因子：IF 8.2
技術平臺：RNA-seq、RIP/meRIP-seq（易基因優勢技術）、 LACE-seq等
本研究從大量AEG患者的m6A調控因子表達譜中發現，與配對的正常鄰近組織相比，IGF2BP3是AEG腫瘤中蛋白表達上調最顯著的m6A調控因子。沉默IGF2BP3可以在在體外和體內抑制AEG進展。通過對AEG中IGF2BP3的全轉錄組靶標和m6A甲基化組分析結果表明，IGF2BP3介導的m6A修飾靶點的穩定性和表達增強，包括細胞周期通路靶點，如CDC25A、CDK4和E2F1，對AEG進展至關重要。從機制上講，CDC25A的m6A修飾增加加速了G1-S期的轉換。臨床上IGF2BP3、METTL3和CDC25A在TCGA泛癌細胞（包括AEG）中的表達上調表現出強正相關。總之，本研究強調了轉錄后調控在調控AEG腫瘤進展中的作用，并闡明了m6A/IGF2BP3/CDC25A軸在AEG細胞中的功能重要性。
研究方法：
結果圖形
（1）IGF2BP3表達上調與AEG患者預后不良相關
圖1：IGF2BP3表達上調與AEG患者預后不良相關。
(A-B) 83個AEG腫瘤相對于鄰近正常組織(m6A調節因子(A)和IGF2BPs(B)的差異表達分析(PRJNA788008))。
(C-E) 83名AEG患者IGF2BPs的ROC分析(C-D)。
(F-G) 5對AEG腫瘤(T)及鄰近正常組織(N)中IGF2BP3的mRNA和蛋白表達水平(n = 5)。
(H) TCGA數據集中23種癌癥類型中IGF2BP3 mRNA水平差異分析。
(I) HPA數據集中16種癌癥類型中IGF2BP3蛋白的表達水平。
(J-K) Kaplan-Meier生存分析顯示AEG患者和TCGA泛癌中IGF2BP3 mRNA表達水平低和高的整體生存率。
（2）IGF2BP3在AEG中的致癌作用
(C-D) IGF2BP3-KD OE-19 (C) 和 SK-GT4 (D) 細胞在未涂層Transwell實驗中的定量分析（左）和代表性顯微照片（右）。
(E-F) IGF2BP3-KD OE-19 (E) 和 SK-GT4 (F) 細胞集落形成實驗中的定量分析（左）和代表性圖像（右）。
(G-I) IGF2BP3-KD OE-19細胞對裸鼠( n = 6)腫瘤大小(G)、腫瘤生長(H)和質量(I)的影響。
(J) KEGG分析顯示IGF2BP3 KD OE-19細胞中下調基因的前20個顯著富集通路。
(K-L) 流式細胞術分析顯示IGF2BP3-KD OE-19 (K) 和 SK-GT4 (L) 細胞在sub-G0-G1期、S期和G2-M期細胞周期階段的百分比(n = 3)。顯示代表性的細胞周期圖譜（左）和定量分析（右）。
（3）IGF2BP3 KD全局下調靶基因表達
(B) 使用meRIP-seq、RIP-seq和LACE-seq數據進行HOMER motif分析檢測到的IGF2BP3結合位點和m6A motif的頂部共有序列。
(C) 餅圖顯示含有m6A peaks的IGF2BP3高置信度靶基因的數量和百分比。
(D) RIP-seq、LACE-seq和meRIP-seq中各種RNA類型百分比。
(E) Metagene分析顯示IGF2BP3結合位點和m6A修飾在mRNA轉錄組中的富集情況。
(F) 不同基因區域內IGF2BP3結合峰和m6A peaks分布。
(G-H) IGF2BP3 KD后，非靶基因、IGF2BP3高置信度靶基因 (G) 以及帶有或不帶有m6A的IGF2BP3高置信度靶基因 (H) 的mRNA log2FC的累積頻率。
(I-J) KEGG分析顯示帶有m6A的IGF2BP3高置信度靶基因的前20個顯著富集通路 (I) 以及帶有m6A的IGF2BP3高置信度靶基因和IGF2BP3 KD中下調基因的重疊基因 (J)。
（4）IGF2BP3以m6A依賴性方式穩定CDC25A轉錄本
(B) IGF2BP3 KD OE-19和SK-GT4細胞中CDC25A的qRT-PCR分析。
(C-D) IGF2BP3 KD (C) 和IGF2BP3過表達 (OE) (D) OE-19（上圖）和SK-GT4（下圖）細胞中CDC25A的免疫印跡分析。
(E) METTL3 KD OE-19和SK-GT4細胞中CDC25A的qRT-PCR分析。
(F-G) METTL3 KD (F) 和METTL3 OE (G) OE-19和SK-GT4細胞中CDC25A的免疫印跡分析。
(H-I) 在IGF2BP3 (H) 或METTL3 (I) KD OE-19細胞中，用5μM放線菌素D（actinomycin D）處理指定時間后CDC25A的半衰期。
（5）CDC25A m6A位點鑒定
(B) m6A RIP-qPCR顯示METTL3 KD OE-19（左）和SK-GT4（右）細胞中CDC25A 3' UTR的m6A修飾富集。
(C) RIP-qPCR顯示METTL3 KD OE-19（左）和SK-GT4（右）細胞中CDC25A 3' UTR的IGF2BP3富集。 (D) CLIP-seq數據集揭示CDC25A 3' UTR中的m6A修飾位點。
(E) qPCR的閾值周期（Ct）顯示METTL3 KD OE-19細胞中CDC25A的A2131、A2142和A2164位點的SELECT結果。
(F) 有或沒有m6A CDC25A 3' UTR探針在OE-19（上圖）和SK-GT4（下圖）細胞中RNA下拉結果中IGF2BP3富集免疫印跡分析。
（6）IGF2BP3通過其3'UTR中的三個m6A位點增加CDC25A表達
(B和C) 雙熒光素酶檢測顯示IGF2BP3或METTL3 KD 293T細胞中CDC25A 3' UTR的熒光素酶活性。(E) 293T細胞用5μM放線菌素D處理指定時間后，耦聯3'UTR野生型和突變型F-Luc半衰期。
(F) 雙熒光素酶檢測顯示293T細胞中CDC25A 3' UTR野生型和突變型的熒光素酶活性。
(G-H) RIP-qPCR顯示轉染了FTO和ALKBH5的dm6ACRISPR系統的OE-19細胞中CDC25A 3' UTR的m6A修飾(G)和IGF2BP3(H)的富集。
(I-J) 轉染了FTO和ALKBH5的dm6ACRISPR系統的OE-19細胞中CDC25A mRNA(I)和蛋白(J)表達的qRT-PCR和免疫印跡分析。
參考文獻：
Pan Y, Feng H, Zhou J, Zhang W, Liu Y, Zheng J, Wang J, Gao S, Li Y. m6A modification enhances the stability of CDC25A promotes tumorigenicity of esophagogastric junction adenocarcinoma via cell cycle. Int J Biol Sci. 2024;20(11):4209-4221. pii: ijbsv20p4209. doi: 10.7150/ijbs.98535. PubMed PMID: 39247830.
2024年08月06日，廣東省人民醫院（廣東省醫學科學院）普外科李勇教授研究團隊和東南大學附屬中大醫院高山教授研究團隊合作在《Int J Biol Sci》雜志發表題為“m6A modification enhances the stability of CDC25A promotes tumorigenicity of esophagogastric junction adenocarcinoma via cell cycle“的研究論文，研究納入30名新診斷的AEG患者，收集其手術后的新鮮樣本后通過RNA-seq、RIP/meRIP-seq、 LACE-seq等分析揭示了m6A修飾增強CDC25A穩定性，進而通過細胞周期促進食管胃結合部腺癌（AEG）的致瘤性。
標題：m6A modification enhances the stability of CDC25A promotes tumorigenicity of esophagogastric junction adenocarcinoma via cell cycle（m6A修飾增強CDC25A穩定性，進而通過細胞周期促進AEG致瘤性）
期刊：International Journal of Biological Sciences（Int J Biol Sci）
影響因子：IF 8.2
技術平臺：RNA-seq、RIP/meRIP-seq（易基因優勢技術）、 LACE-seq等
本研究從大量AEG患者的m6A調控因子表達譜中發現，與配對的正常鄰近組織相比，IGF2BP3是AEG腫瘤中蛋白表達上調最顯著的m6A調控因子。沉默IGF2BP3可以在在體外和體內抑制AEG進展。通過對AEG中IGF2BP3的全轉錄組靶標和m6A甲基化組分析結果表明，IGF2BP3介導的m6A修飾靶點的穩定性和表達增強，包括細胞周期通路靶點，如CDC25A、CDK4和E2F1，對AEG進展至關重要。從機制上講，CDC25A的m6A修飾增加加速了G1-S期的轉換。臨床上IGF2BP3、METTL3和CDC25A在TCGA泛癌細胞（包括AEG）中的表達上調表現出強正相關。總之，本研究強調了轉錄后調控在調控AEG腫瘤進展中的作用，并闡明了m6A/IGF2BP3/CDC25A軸在AEG細胞中的功能重要性。
研究方法：
- 納入30名新診斷AEG患者，收集了手術后的新鮮樣本。
- 使用人AEG細胞系進行細胞培養，并進行質粒轉染。
- qRT-PCR、免疫印跡等方法分析基因和蛋白表達。
- 細胞增殖、遷移、集落形成實驗、熒光素酶報告基因檢測等功能性實驗。
- RNA-seq、RIP/meRIP-seq、LACE-seq等測序分析。
- 裸鼠模型的體內實驗評估IGF2BP3 KD或CDC25A過表達對腫瘤形成和生長的影響。
結果圖形
（1）IGF2BP3表達上調與AEG患者預后不良相關
圖1：IGF2BP3表達上調與AEG患者預后不良相關。
(C-E) 83名AEG患者IGF2BPs的ROC分析(C-D)。
(F-G) 5對AEG腫瘤(T)及鄰近正常組織(N)中IGF2BP3的mRNA和蛋白表達水平(n = 5)。
(H) TCGA數據集中23種癌癥類型中IGF2BP3 mRNA水平差異分析。
(I) HPA數據集中16種癌癥類型中IGF2BP3蛋白的表達水平。
(J-K) Kaplan-Meier生存分析顯示AEG患者和TCGA泛癌中IGF2BP3 mRNA表達水平低和高的整體生存率。
（2）IGF2BP3在AEG中的致癌作用
圖2：IGF2BP3在AEG中發揮致癌作用。
(A-B) 評估IGF2BP3敲低（KD）OE-19 (A) 和 SK-GT4 (B) 細胞的細胞增殖實驗。(C-D) IGF2BP3-KD OE-19 (C) 和 SK-GT4 (D) 細胞在未涂層Transwell實驗中的定量分析（左）和代表性顯微照片（右）。
(E-F) IGF2BP3-KD OE-19 (E) 和 SK-GT4 (F) 細胞集落形成實驗中的定量分析（左）和代表性圖像（右）。
(G-I) IGF2BP3-KD OE-19細胞對裸鼠( n = 6)腫瘤大小(G)、腫瘤生長(H)和質量(I)的影響。
(J) KEGG分析顯示IGF2BP3 KD OE-19細胞中下調基因的前20個顯著富集通路。
(K-L) 流式細胞術分析顯示IGF2BP3-KD OE-19 (K) 和 SK-GT4 (L) 細胞在sub-G0-G1期、S期和G2-M期細胞周期階段的百分比(n = 3)。顯示代表性的細胞周期圖譜（左）和定量分析（右）。
（3）IGF2BP3 KD全局下調靶基因表達
圖3：IGF2BP3 KD 全局下調靶基因表達。
(A) 在OE-19細胞中通過RIP-seq和LACE-seq鑒定IGF2BP3靶基因的重疊。(B) 使用meRIP-seq、RIP-seq和LACE-seq數據進行HOMER motif分析檢測到的IGF2BP3結合位點和m6A motif的頂部共有序列。
(C) 餅圖顯示含有m6A peaks的IGF2BP3高置信度靶基因的數量和百分比。
(D) RIP-seq、LACE-seq和meRIP-seq中各種RNA類型百分比。
(E) Metagene分析顯示IGF2BP3結合位點和m6A修飾在mRNA轉錄組中的富集情況。
(F) 不同基因區域內IGF2BP3結合峰和m6A peaks分布。
(G-H) IGF2BP3 KD后，非靶基因、IGF2BP3高置信度靶基因 (G) 以及帶有或不帶有m6A的IGF2BP3高置信度靶基因 (H) 的mRNA log2FC的累積頻率。
(I-J) KEGG分析顯示帶有m6A的IGF2BP3高置信度靶基因的前20個顯著富集通路 (I) 以及帶有m6A的IGF2BP3高置信度靶基因和IGF2BP3 KD中下調基因的重疊基因 (J)。
（4）IGF2BP3以m6A依賴性方式穩定CDC25A轉錄本
圖4：IGF2BP3以m6A依賴性方式穩定CDC25A轉錄本。
(A) 在IGF2BP3 KD后，以m6A依賴性方式結合IGF2BP3的細胞周期相關基因的差異表達分析。(B) IGF2BP3 KD OE-19和SK-GT4細胞中CDC25A的qRT-PCR分析。
(C-D) IGF2BP3 KD (C) 和IGF2BP3過表達 (OE) (D) OE-19（上圖）和SK-GT4（下圖）細胞中CDC25A的免疫印跡分析。
(E) METTL3 KD OE-19和SK-GT4細胞中CDC25A的qRT-PCR分析。
(F-G) METTL3 KD (F) 和METTL3 OE (G) OE-19和SK-GT4細胞中CDC25A的免疫印跡分析。
(H-I) 在IGF2BP3 (H) 或METTL3 (I) KD OE-19細胞中，用5μM放線菌素D（actinomycin D）處理指定時間后CDC25A的半衰期。
（5）CDC25A m6A位點鑒定
圖5：鑒定CDC25A的m6A位點。
(A) 基于meRIP-seq、IGF2BP3 RIP-seq和LACE-seq數據（n=2）的CDC25A轉錄本峰值分布。(B) m6A RIP-qPCR顯示METTL3 KD OE-19（左）和SK-GT4（右）細胞中CDC25A 3' UTR的m6A修飾富集。
(C) RIP-qPCR顯示METTL3 KD OE-19（左）和SK-GT4（右）細胞中CDC25A 3' UTR的IGF2BP3富集。 (D) CLIP-seq數據集揭示CDC25A 3' UTR中的m6A修飾位點。
(E) qPCR的閾值周期（Ct）顯示METTL3 KD OE-19細胞中CDC25A的A2131、A2142和A2164位點的SELECT結果。
(F) 有或沒有m6A CDC25A 3' UTR探針在OE-19（上圖）和SK-GT4（下圖）細胞中RNA下拉結果中IGF2BP3富集免疫印跡分析。
（6）IGF2BP3通過其3'UTR中的三個m6A位點增加CDC25A表達
圖6：IGF2BP3通過其3' UTR中的三個m6A位點增加CDC25A表達。
(A和D) 在IGF2BP3和METTL3 KD 293T細胞中，用5μM放線菌素D處理指定時間后，耦聯3'UTR野生型(A)和突變型(D)F-Luc半衰期。(B和C) 雙熒光素酶檢測顯示IGF2BP3或METTL3 KD 293T細胞中CDC25A 3' UTR的熒光素酶活性。(E) 293T細胞用5μM放線菌素D處理指定時間后，耦聯3'UTR野生型和突變型F-Luc半衰期。
(F) 雙熒光素酶檢測顯示293T細胞中CDC25A 3' UTR野生型和突變型的熒光素酶活性。
(G-H) RIP-qPCR顯示轉染了FTO和ALKBH5的dm6ACRISPR系統的OE-19細胞中CDC25A 3' UTR的m6A修飾(G)和IGF2BP3(H)的富集。
(I-J) 轉染了FTO和ALKBH5的dm6ACRISPR系統的OE-19細胞中CDC25A mRNA(I)和蛋白(J)表達的qRT-PCR和免疫印跡分析。
參考文獻：
Pan Y, Feng H, Zhou J, Zhang W, Liu Y, Zheng J, Wang J, Gao S, Li Y. m6A modification enhances the stability of CDC25A promotes tumorigenicity of esophagogastric junction adenocarcinoma via cell cycle. Int J Biol Sci. 2024;20(11):4209-4221. pii: ijbsv20p4209. doi: 10.7150/ijbs.98535. PubMed PMID: 39247830.
標簽：
RNA甲基化
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