脂質納米顆粒(lipid nanoparticle, LNP)已被廣泛應用于遞送siRNA和mRNA等核酸藥物，其不僅保護RNA不被降解，并且促進了核酸向靶細胞和組織的遞送。隨著研究的深入，人們發現LNP中脂質分子和核酸的組裝模式顯著影響著下游的生物學性能，如細胞毒性、血液循環時間和負載RNA活性等。近期有研究報道通過調控LNP的脂質組成所形成的反六邊形結構可有效提高siRNA在細胞內的基因沉默效率。因此，LNP內部結構解析對于核酸裝載LNPs的研發和質量控制至關重要。目前，小角度X射線散射(small-angle X-ray scattering, SAXS)和小角度中子散射(small-angle neutron scattering, SANS）是對LNP內部結構和脂質定位分析最常用的技術手段，但以上兩種方法嚴重依賴于特定大型儀器設備。因此，亟需開發一種通用性強的分析方法以評估LNP內部結構的分子組成。

近日，來自日本千葉大學的Keisuke Ueda團隊在Journal of Controlled Release上發表了研究論文“NMR-based analysis of impact of siRNA mixing conditions on internal structure of siRNA-loaded LNP”。該文章利用溶液態¹H NMR探討了不同制備方法所得siRNA LNP內部結構變化，并聯合NMR、NanoFCM、SAXS和Cryo-TEM等多項技術探究了不同siRNA混合條件對所得siRNA LNP的分子組成和內部結構的影響。

01 siRNA-LNPs的制備工藝
如圖1所示，作者選取4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亞油基)甲酯(DLin-MC3-DMA, MC3)為可電離脂質，并參考已商品化的LNP合成配方(MC3：DSPC：cholesterol：DMG-PEG = 50:10:38.5:1.5)，使用三種不同制備方法，以考察不同siRNA混合條件對siRNA-LNPs組裝的影響。

01 預混合法
使用微流控混合器將含有siRNA的酸性溶液與脂質的乙醇溶液預先混合，隨后使用磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS，pH 7.4)進行透析，制備siRNA LNPs。

02 后混合法(A)
在與預混合法相同的條件下，使用iLiNP裝置將脂質溶液和不含siRNA的醋酸鹽緩沖液(pH 4.0)混合，先制備得到空載的LNP；隨后，將siRNA儲存液加入到酸性的空LNP中，倒置混合后，用PBS(pH 7.4)透析所得混合物，制備混合后的LNP(A)。

03 后混合法(B)
用上述相同方法制備空LNP后，用醋酸鹽緩沖液(pH 4.0)對其進行透析，隨后將siRNA 儲存液加入其中，倒置混合后用PBS(pH 7.4)透析，制備混合后的LNP(B)。
 

圖1. siRNA LNPs的制備方法示意圖

02 不同混合條件下siRNA-LNPs理化性質
DLS和Cyro-TEM結果顯示裝載有siRNA的LNP粒徑較空LNP略大，且后混合法比預混合法得到的siRNA-LNPs粒徑更大，并伴隨著70 nm以上顆粒數量的增加。推測這一現象是由于在混合初期形成了粒徑較大的LNP前驅體。Cryo-TEM成像下，空載LNP和siRNA LNPs形態無顯著差別，即通過形態無法判斷LNPs是否成功裝載了siRNA分子。此外，RiboGreen核酸定量法顯示三種制備方法所得LNPs的核酸包封率均超過95%，且無顯著差別。

作者進一步使用NanoFCM在單LNP水平對siRNA的裝載情況進行分析。結果顯示三種方法制備的siRNA LNPs中空載LNP的比例均低于3.5%，且顆粒粒徑大小（散射）與核酸裝載量（熒光）呈正相關（圖2a）。此外，在預混合法制備的LNPs中，大部分顆粒都位于紅色虛線所劃分的區域，即相似大小的LNP顆粒之間的siRNA負載變化較小，而后混合法制備的LNPs顯示出更寬的粒徑范圍以及更強的熒光信號，即后混合法在提高LNP粒徑的同時可提高單個LNP上siRNA的裝載量。同時，SAXS測量結果顯示，預混合和后混合的LNPs均形成了siRNA-MC3堆疊雙層結構(圖2b)。
 

圖2. 不同方法制備的siRNA封裝效率(a)和SAXS圖譜(b)

03 混合條件對siRNA LNP組裝結構的影響
如圖3所示，NMR在分子水平表征進一步揭示了不同混合條件所得siRNA LNPs的組裝差異。在預混合法所得LNPs中，由于siRNA和MC3之間的相互作用使其在整個LNP中均勻分布。而后混合法所得LNPs則存在siRNA富集和空siRNA的區域。這可能是由于在混合過程中，帶正電荷的囊泡在局部高siRNA濃度的區域與之形成復合物，從而形成siRNA富集區域。而另外一些帶正電荷的囊泡沒有與siRNA發生相互作用，導致空siRNA區域的出現。此外，后混合法LNP(B)中siRNA富集和空siRNA區域比后混合法LNP(A)更明顯，可能是由于早期乙醇的存在促進siRNA-MC3堆疊雙層結構的均勻混合和形成。
 

圖3. 不同混合條件得到的siRNA-LNP示意圖

結合下游細胞實驗，發現siRNA在LNPs中分布的均勻性會顯著影響siRNA的沉默效率。基于NMR對siRNA LNP內部結構的表征，可揭示siRNA LNP的分子水平異質性，對于優化siRNA LNP制劑的制備條件具有重要意義。

展望
隨著疫情的結束，RNA療法研究方向轉變為更廣泛的治療性疫苗或藥物。不管是藥物的包封工藝開發、分析方法開發還是終產品的質控，都需要全面了解核酸藥物的性質。工欲善其事必先利其器，NanoFCM開創性地提出了一種高靈敏、快速、直接、無損的核酸藥物解決方案，適用于siRNA LNP、mRNA LNP等多種核酸藥物的綜合表征，為mRNA疫苗等核酸納米藥物的研發和質量控制提供了重要的技術保障，這將極大加快核酸療法的基礎研究和臨床轉化進程。
 

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