熒光顯微成像具有高分辨率、高靈敏度、高分子特異性以及非介入性的優點，可以在微米乃至納米尺度下表征樣本的形態學與分子功能學信息，成為了生命科學研究的重要工具。

隨著微觀生物學研究的不斷深入，熒光顯微成像被期待能夠動態且立體地觀測微觀生物結構與分子事件。

西安電子科技大學的閆天宇、何穎團隊在《紅外與激光工程》發表文章《快速三維熒光顯微成像技術的研究進展（特邀）》，系統性地梳理了近年來快速三維熒光顯微成像技術的研究進展，并展望了快速三維熒光顯微成像技術的未來挑戰與發展前景。

點掃描式三維熒光顯微成像技術

技術原理與應用
使用具有層析能力的熒光顯微鏡逐層成像獲得圖像堆棧，以CLSM和TPM為代表的掃描式顯微鏡具有更高的穿透深度、成像信噪比和光學切片能力，常用于細胞成像、在體組織成像、腦神經元研究等領域。

如Zhu等人使用自行合成的近紅外二區造影劑在CLSM系統中實現對腦組織切片的三維體積成像；Yang等人將雙光子光遺傳學與雙光子鈣體積成像相結合進行在體三維測量和操縱小鼠大腦皮層的神經活動。

提高成像速度的方法
1、減少掃描維度：早期的線掃描策略可從一個方向屏蔽焦外信號，但會降低成像質量，提高機械掃描組件掃描轉子的頻率可獲得更高的掃描速度。如Piyawattanametha等人開發的二維單晶硅掃描鏡用于TPM和顯微內窺鏡中，Boutilier等人通過安裝多面鏡提高TPM水平方向上的快軸掃描速度。

2、多焦點并行掃描：同時偏轉復數個光束進行多焦點并行式高速掃描。如Zhang等人使用掃描振鏡和微透鏡陣列實現400個焦點的并行式掃描，或使用轉盤式掃描顯微鏡，如Oketani等人使用針孔陣列盤作為掃描單元進行快速成像。

3、時間延遲多焦點掃描：基于時間延遲的多路復用的多焦點掃描技術，允許高速高靈敏度的單點探測器采集多焦點的時間信號序列進行圖像重構。如Wu等人在TPM中令非平行的脈沖激光束在反射鏡之間多次反射以分離不同波矢方向的子脈沖，配合一維掃描振鏡與光電倍增管實現快速采樣。

4、提升軸向掃描效率：將變焦透鏡引入成像系統通過高速變焦進行軸向快速掃描。如Chien將軸向掃描頻率高達1MHz的可調諧聲學梯度指數鏡頭應用于雙光子顯微鏡中，或在照明光路中設置可沿光軸方向快速移動的反射鏡結合多路復用技術，也可利用貝塞爾光等無衍射光束實現快速體積成像。

增強空間分辨率的方法
利用多焦點結構光照明顯微鏡、4Pi顯微鏡技術、受激輻射損耗顯微鏡等可實現超分辨三維成像，如York等人開發的多焦點結構光照明顯微鏡獲得了145nm的橫向分辨率，Velasco等人結合雙光子照明、自適應光學和近紅外熒光探針等技術獲得了深度可達164μm的三維超分辨熒光顯微圖像。

存在的問題
提高掃描速度會導致單個采樣點的光子產量及曝光時間下降，對光子預算的規劃要求更為嚴格，系統的復雜化會導致成本提高。此外，超分辨技術應權衡分辨率、視野和成像時間之間的關系。

寬場式三維熒光顯微成像技術
光片熒光顯微鏡
技術原理與優勢
采用薄片狀的照明光源替代常規顯微鏡中的柱形光源，只有在光片內部的熒光分子被高效率激發，產生較少的焦外信號，提高了圖像對比度，且大幅度降低了對生物樣本的光毒性，在橫向上可由面陣探測器直接成像，采集圖像堆棧只需執行一個維度的掃描，適合長時間實時成像。

如Liu等人將晶格光片顯微鏡與自適應光學相結合實現對大體積多細胞樣本中亞細胞過程的無創無像差成像，Fei等人將像素超分辨技術加入到光片顯微鏡中實現對大體積樣本的各向同性的高分辨率成像。

提高成像速度的方法
基于振鏡和可變焦透鏡的高速掃描策略可用于光片顯微鏡中，如Fahrbach等人利用透鏡掃描實現對跳動的斑馬魚心臟內的平面進行快速成像；Haslehurst等人在光片顯微鏡中加入振鏡進行快速軸向掃描并配合電控可調諧鏡頭同步采集圖像；擴展景深也可提高成像速度，如Lin等人通過將軸棱錐加入到雙光子光片熒光顯微鏡中產生拓展景深，Olarte等人通過使用波前編碼技術在光片顯微鏡中擴展檢測光學器件景深；

此外，單物鏡式光片顯微鏡被開發出來，如Yang等人在落射式熒光顯微鏡中生成傾斜的光片并在像方光路選擇區別于照明光路的視野實現單物鏡光片顯微鏡，Cai等人在落射式熒光顯微鏡中生成沿軸向傳播的光片照明并設置微鏡陣列配合一維掃描實現單物鏡、正入射式的光片顯微鏡。

光場熒光顯微鏡
技術原理與存在的問題：通過在像方光路中設置微透鏡陣列的方式同時獲取光的強度和角度信息，可在不執行掃描的條件下重建樣本的三維信息，具有天然的速度優勢，但三維成像能力以犧牲橫向分辨率為代價，且在三維視場上的分辨率不均勻。

提高分辨率的方法：通過反卷積的圖像重建方法、數字自適應光學掃描光場相互迭代斷層掃描的計算成像框架、在光路中加入衍射光學元件等可增強分辨率。如Prevedel等人通過反卷積的圖像重建方法獲得了1.4μm的有效分辨率，Wu等人提出的計算成像框架將光場顯微鏡的橫向分辨率和軸向分辨率分別提升至了220nm和400nm，Pan等人通過在樣品和顯微鏡物鏡之間插入透射式光柵提升軸向分辨率，He等人通過在光場顯微鏡的傅里葉平面上放置衍射光學元件實現一種快照多焦光場顯微成像方法獲得較大的場深。

提高成像速度的方法：使用兩個互相垂直的物鏡同時獲取正交光場進行雙視圖數據融合并反卷積、利用高分辨率的二維圖像和低分辨率的四維光場圖像通過反卷積和相位恢復的混合算法、結合光場顯微鏡與深度學習成像技術等可提高成像速度。

如Wagner等人使用兩個互相垂直的物鏡實現高達200Hz的無運動偽影體積成像，Geng等人利用混合算法將圖像重建的計算速度提高了4倍，Wang等人結合光場顯微鏡與深度學習成像技術實現對跳動的斑馬魚心臟中的血流進行成像，體積成像速率也達到了200Hz。

提高圖像質量的方法：光場顯微鏡可和其他先進照明策略結合以提升圖像質量，如Truong等人構建基于光場的選擇性體積照明顯微鏡降低背景噪聲并獲得分辨率增強效果，Wang等人將光片照明技術應用于光場顯微鏡使其成像對比度增強、信噪比提升，Zhang等人將共焦檢測方案與光場顯微鏡結合獲取光學切片能力以及提高成像深度。

寬場超分辨顯微鏡
結構光照明超分辨成像：通過對樣本施加干涉條紋并相移來實現樣本圖像的超分辨率重建，二維結構光照明技術只能提升橫向分辨率，三維結構光可重建出樣本的三維超分辨率熒光圖像，但對像差敏感，成像深度有限。通過將自適應光學技術引入到三維結構光照明成像中可消除像差，提高成像深度，如Lin等人通過將自適應光學技術引入到三維結構光照明成像中成功將其成像深度提高至80μm。

單分子定位超分辨成像：對視野內的熒光分子進行稀疏性激發，使臨近的熒光分子不同時發光，進而允許在每次成像時對零散的熒光分子以納米級精度定位，成像進行成千上萬次即可重構出一張超分辨圖像。基于單分子定位的成像技術已被證明可以在橫向和軸向均獲得超分辨率能力，且可通過適用于單分子定位的盲修復圖像重建方法降低對數據量的要求，提高成像速度，如莊小威等人提出的三維單分子定位超分辨成像方案實現了橫向 30nm、軸向60nm的單分子定位精度，莊小威等人在2011年以類似的分辨率實現了0.5Hz的體積成像速率，Wang等人提出的盲修復圖像重建方法可從低密度圖像中恢復精細結構并提高成像速度。

光學漲落超分辨成像：通過捕捉獨立分布的熒光分子的閃爍狀態而實現分辨率增強，可直接使用寬場熒光顯微鏡采集的時間圖像序列完成超分辨圖像重建，具有低成本、適用廣泛的優點，但分辨率提升效果受限于探測器像素尺寸，可通過基于傅里葉變換的插值方案突破像素尺寸的限制，提高分辨率增強的上限，如Stein等人提出的基于傅里葉變換的插值方案可重建出像素密度更高的圖像且不會引入偽影。

寬場式三維熒光顯微成像在克服傳統寬場顯微鏡缺陷的同時，憑借更低的光毒性以及數據采集維度的優勢，成為了實時體積成像的強有力工具，允許科研人員對微觀視野下短暫的分子事件進行動態追蹤。超分辨技術的加入則使得寬場顯微成像可以在時間分辨率和空間分辨率之間進行取舍。

投影斷層式三維熒光顯微成像技術

技術原理
類似于使用X射線的計算機斷層掃描，在光學波段對樣本進行多角度彈道式照明獲取投影數據集可以對樣本實現三維斷層重建，即光學投影斷層成像技術（OPT）。

應用與優勢
OPT已被證明可以用于某些光學透明度較高的活體生物進行全身斷層重建，結合熒光標記技術，可對生物樣本內部的光吸收和熒光信號進行三維追蹤。

如Bassi等人利用OPT技術以無標記的形式實現對弱散射活體樣本的血管網絡的可視化與三維斷層重建；Arranz等人利用OPT技術對黑腹果蠅蛹進行三維斷層掃描并捕捉到蛹內頭部外翻過程的體積圖像；McGinty等人使用綠色熒光蛋白標記斑馬魚胚胎后成功對其進行包含熒光壽命信息的光學投影斷層掃描。

相比于點掃描需要對樣本進行數百萬至數千萬次采樣才能重建出三維圖像，結合OPT技術的三維熒光顯微成像僅需獲得數百個不同角度的投影即可完成采樣并斷層重建，并且可以檢測厚度在毫米量級的樣本。

提高成像速度的方法
1、減少數據采集時間：開發樣品在旋轉軸上的半自動精確定位方法，并結合數據采集后的自動校正算法，可減少數據采集時間并提高重建后的圖像質量，如Cheddad等人開發的定位方法獲得了0.01pixel的校正精度。

2、提高重建時對數據的利用效率：采用基于調制傳遞函數的頻率截止濾波器作為重建時的附加濾波器，可在抑制重建偽影的同時降低對數據量的要求，提高數據采集速度，如Chen等人采用該濾波器將數據采集速度提高了4倍。

4、開發適用于有限角度投影以及稀疏投影的重建方法：基于各項異性全變分極小化的重建方法可在重建有限角度的投影數據時獲得明顯優于經典方法的圖像質量。

如Chen等人提出的該重建方法；結合代數重建與先驗信息的方法可減少采集投影的范圍；如Wang等人通過優化樣本固定方式提高活體樣本的縱向檢測能力并結合代數重建與先驗信息的方法僅需采集130°范圍內的投影即可重建出質量可接受的圖像；基于稀疏視圖數據的稀疏重建方案結合代數重建和全變分正則化的迭代重建方法，可減少用于重建的投影數量，如Chen等人提出的該方案用于重建的投影數量可降低至15個；基于兩階段深度學習網絡的框架用于稀疏投影的重建與去噪，可進一步減少所需的投影數量，如Wang等人提出的該框架可將所需的投影數量進一步降低至9個。

存在的問題
OPT技術對樣本的光學透過率要求較高，對于不透明的樣本需要先進行透明化預處理，因此可以檢測的活體樣本的種類有限，并會丟失在透明化處理中被去除的生物信息。

總結與展望
現有技術方案在一定程度上已經允許對部分微觀尺度上的生物分子事件進行三維動態跟蹤，但仍存在一些因素在限制實時體積成像的進一步發展，包括數據處理的實時性較差、光學顯微成像的深度受限、視場有限以及基于熒光標記的顯微成像技術難以描述樣本的全部分子事件等。

隨著各種先進光學成像技術的發展與融合，實時三維光學顯微成像將會有進一步突破，提供更加完善的微觀生物信息。

內容來源：
閆天宇,何穎,王鑫宇,徐欣怡,謝暉,陳雪利.快速三維熒光顯微成像技術的研究進展（特邀）[J].紅外與激光工程,2022,51(11):20220546.Tianyu Yan,Ying He,Xinyu Wang,Xinyi Xu,Hui Xie,Xueli Chen.Research progress on fast 3D fluorescence microscopic imaging (invited)[J].Infrared and Laser Engineering,2022,51(11):20220546.