雙光子顯微成像具備高分辨率、天然層析能力和大穿透深度等特點，在活體動物成像中發揮著重要作用。然而，如何在維持高分辨率的條件下，擴大雙光子的成像視場，來滿足生物醫學中對大規模動態反應的監測需求，一直以來都是光學顯微成像領域的難點，也是科研關注的重點。

香港理工大學姚靖、余志鵬團隊在《紅外與激光工程》發表文章，綜述了大視場雙光子成像技術的研究進展。介紹了雙光子顯微成像系統的產生背景和設計原理，并從光學不變量的角度闡述了實現大視場雙光子成像的理論基礎，并重點回顧了現有的幾種大視場雙光子成像方法。

基于雙光子成像的高時間和空間分辨特性，大視場雙光子成像技術將成為一種在腦科學等需介觀高分辨成像領域的應用中實現大區域動態監測的強有力的工具。

大視場雙光子成像的理論基礎
實現大視場、高分辨率的雙光子成像的難度在于保證分辨率的同時增加成像視場。成像物鏡的數值孔徑決定了系統成像的衍射極限分辨率，而物鏡放大倍數和視場數決定了成像系統的最大成像視場。

另外，在雙光子系統中，可用一個光學量來同時衡量各光學元件(系統)的衍射極限分辨率和視場大小，人們稱之為光學不變量，光學不變量可同時衡量光學元件的衍射極限分辨率和視場大小。對于大視場雙光子成像系統，需要挑選或特殊設計具有大光學不變量的元件。

具體來說，在設計大視場雙光子成像系統時，可將其大致分為三部分進行分塊設計優化，分別為成像物鏡、掃描中繼系統與熒光收集系統。在設計時，應選擇低放大倍數的成像物鏡，并對比其光學不變量；掃描中繼系統應減少大角度掃描時產生的離軸像差；熒光收集系統的光學不變量也應等于或大于選定物鏡的光學不變量。

大視場雙光子成像與其應用

掃描中繼系統的邊緣像差校準
雙光子成像系統屬于激光點掃描式顯微鏡的一種，要實現大視場雙光子成像，必須進行大角度掃描以增加實際光學不變量。然而，大角度掃描過程中由掃描系統引起的像差會對整個系統的成像性能造成較大影響。

2015年，Philbert S.Tsai等提出了一種使用大孔徑的多透鏡組合的方法，減小了掃描系統引起的像差，實現接近于衍射極限的高分辨率大視場雙光子成像。

該方法主要是從傳統光學設計角度以及光學像差的光學補償角度優化大視場成像系統，通過補償大視場掃描引起的大離軸像差，最終在近衍射極限的分辨率下監測到了不同腦區的血管以及神經活動。

高通量物鏡的設計研發
成像物鏡的光學不變量限制了整個雙光子成像系統的光學不變量，也限制了最終的成像視場與分辨率。所以無論對物鏡前的光路進行多復雜的特殊設計，最終影響整個大視場雙光子系統的關鍵元件仍然是物鏡。目前市面上支持大光學不變量的商業物鏡有限，同時這些商業物鏡支持的最大視場也有限。因此，要實現更大視場的高分辨雙光子成像，使用高通量的自制成像物鏡是將成像視場進一步拓展的關鍵。

2016年，Nicholas James Sofroniew等設計的用于大視場成像的雙光子隨機掃描顯微鏡（2-p RAM），其最大可實現成像視場為5mm×5mm，并具有亞細胞級別的近衍射極限的分辨率。該系統使用自主設計的高性能、大光學不變量成像物鏡實現大視場高分辨雙光子成像。最終他們通過該系統對麻醉的轉基因小鼠實現了大視場的神經活動分析。

該大視場成像系統的主要亮點在于同時的跨多區域成像。最終他們通過該大視場多區域系統測量了小鼠視覺處理過程中兩個皮層視覺區域之間的活動相關性。

總的來說，在活體生物成像中，大視場掃描的同時不可避免的會降低成像的速度，這會造成對生物組織的光漂白和光毒性增加，同時也會造成熒光信號的衰減。所以快速大視場掃描和同時多區域掃描是兩種可將大視場雙光子顯微鏡拓展至生物醫學應用領域的有效思路。

自適應光學方法的使用
通常情況下，商業成像物鏡都會有一個廠商標定的最大成像視場區域。在該區域內，物鏡廠商通過光學設計盡可能的對像差進行優化。而超過該標定視場時，像差會急劇的增加。

2022年，Yao等提出一種更通用的大視場雙光子方法。該系統最終成像視場直徑為3.46mm，軸向分辨率為0.84μm，軸向分辨率為5.8μm。在不改變系統復雜度和無需復雜設計的前提下，該技術通過自適應光學實現了大視場、高分辨和高信噪比的雙光子成像。

該策略通過自適應光學技術來補償超過標定視場掃描過程中成像物鏡產生的大離軸像差。該技術具有較好的通用性，一方面不僅適用于普通的大視場雙光子成像系統，對于傳統的含高倍數物鏡的小視場雙光子顯微鏡，也可在光路前加入波前矯正元件來拓展其最大視場。另一方面，可以將該技術拓展到任何激光掃描顯微成像領域，通過像差補償元件的加入成功增加成像系統的可用視場。

大視場雙光子腦成像的應用優勢
通過各類方法提高雙光子成像系統的成像視場，能在保證其高分辨率的情況下，增大可探測區域。具體來說，相比于傳統的雙光子成像，大視場雙光子成像系統可將成像視場直徑拓展至5-10倍，即在保證亞細胞級別分辨率的情況下將探測區域最大拓展100倍左右。目前，雙光子用于小鼠腦成像主要有兩個方向：腦內血管成像和腦內神經元或鈣離子成像。

大視場雙光子腦內血管成像能夠分辨全腦或多腦區小鼠腦內血管狀態，為腫瘤分析、缺血或敗血模型等病理應用提供一種有效的工具。在小鼠腦內神經元或鈣離子成像中，支持感覺編碼和運動輸出的神經元活動分布在新皮質的多個區域。從大視場雙光子神經元或鈣離子成像結果中可以看出，大視場雙光子成像系統可以同時跨多個皮層區域成像，從而獲得擴展皮質網絡的細胞分辨率視圖，這對多皮層協調的神經活動或系統的闡明神經編碼的原理至關重要。

總結與展望
大視場雙光子成像是雙光子成像領域的新方向，雖然已有多種大視場成像技術，但在實際應用中仍面臨設計難度和成本等問題。

未來，需要一種更通用、更具性價比的方式來解除成像視場的限制。此外，將大視場成像技術與其他領域技術相結合，如貝塞爾掃描技術、光透明技術和光學波前整形技術等，將是大視場雙光子成像的發展方向，有望實現大視場大深度的雙光子成像。

聲明：本文僅用作學術目的。文章來源于:姚靖,余志鵬,高玉峰,葉世蔚,鄭煒,賴溥祥.大視場雙光子顯微成像系統研究進展（特邀）[J].紅外與激光工程,2022,51(11):20220550.Jing Yao,Zhipeng Yu,Yufeng Gao,Shiwei Ye,Wei Zheng,Puxiang Lai.Advances of large field-of-view two-photon microscopy system (invited)[J].Infrared and Laser Engineering,2022,51(11):20220550.