文獻解讀：DNA甲基化保護早期胚胎線粒體基因組穩定性
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在早期哺乳動物胚胎中，線粒體氧化代謝增強是著床后生存和發育的重要特征；著床前期的線粒體重塑是正常胚胎發生的關鍵事件。在這些變化中，氧化磷酸化（OXPHOS）增強對于支持著床后胚胎的高能量需求至關重要，但線粒體氧化代謝的增強，同時也導致線粒體內大量ROS的積累，由此產生的線粒體氧化應激會破壞早期胚胎線粒體DNA（mtDNA）穩定性。在圍植入期，盡管多種抗氧化機制會被激活以清除細胞內大量的ROS，但線粒體內部是否存在對抗氧化應激的自我保護機制，一直都不清楚。同時線粒體基因組在此過程中發生DNA甲基化，它與線粒體應激增強的時空重合，那mtDNA甲基化是否在維持線粒體基因組穩定性方面發揮作用呢？
近期，中國農業大學動物科學技術學院動物繁殖與發育科學系岳媛博士和任立坤博士為論文共同第一作者、田見暉教授和安磊教授為論文共同通訊在美國科學院院刊（PNAS）正式發表了題為“Mitochondrial genome undergoes de novo DNA methylation that protects mtDNA against oxidative damage during the peri-implantation window“的研究論文，研究揭示了早期胚胎通過線粒體DNA de novo甲基化（de novo mtDNA methylation）保護線粒體基因組穩定性的全新機制。
標題：線粒體基因組經歷從頭DNA甲基化，保護mtDNA在圍植入期免受氧化損傷。
期刊：P NATL ACAD SCI USA（PNAS）
影響因子：IF 9.4 / Q1
結果圖形
（1）著床前期窗口期間mtDNA從頭甲基化與線粒體氧化應激時空重疊。
使用甲基化DNA免疫沉淀測序（MeDIP-seq）分析小鼠E3.5囊胚、E7.5上胚層和E10.5胚胎的mtDNA甲基化模式，這些時間點代表核基因組DNA從頭甲基化的發育窗口。
圖1：著床前窗口期間mtDNA從頭甲基化與線粒體氧化應激的時空重疊。
A. 比較E3.5和E7.5胚胎的總ATP（adenosine triphosphate）水平(左)、OXPHOS依賴性ATP產生（中）和相對貢獻（右）。
B. E3.5和E7.5胚胎的線粒體膜電位。右側通過定量紅色(JC-1聚集體)：綠色(JC-1單體)熒光比例來測量線粒體膜電位。
C. MitoSOX(一種特異性線粒體探針)檢測E3.5和E7.5胚胎內線粒體ROS熒光圖像。右側:定量檢測內線粒體ROS水平。
D. MeDIP-seq檢測小鼠線粒體基因組在E3.5、E7.5和E10.5胚胎中的甲基化譜。y軸顯示每500bp MeDIP-reads的歸一化富集。在線性化mtDNA圖譜下方的注釋顯示mtDNA元件的位點。
E. 基于三個發育階段的MeDIP富集評分，對線粒體基因組的所有區間進行熱圖分析。右側：E3.5時不同平均富集評分的三個子類的mtDNA甲基化動態。
F. 具有相對高（≥2.6%，HCP）、中等（>1.2%且<2.6%，ICP）或低（≤1.2%，LCP）CpG密度的三個子類別區間的mtDNA甲基化動態。
G. 在三個發育階段具有不同富集評分的富集區間比例。
H. 使用MeDIP-qPCR檢測著床前期連續發育階段選定區域的相對甲基化水平，包括重鏈和輕鏈蛋白編碼基因（Nd5, Nd6）、非編碼基因（12s）以及調控區域（D-loop）。數據表示三個重復的平均值±標準差。*P < 0.05，**P < 0.01。
(2) DNMT3A和DNMT3B在發育過程中進入到線粒體中并催化mtDNA從頭甲基化。
圖2：DNMT3A和DNMT3B在發育過程中進入到線粒體中并催化mtDNA從頭甲基化。
A-B. 在E3.5、E7.5和E10.5胚胎中，對TOM20標記的線粒體（環狀橫截面）與DNMT3A（A）或DNMT3B（B）的互作進行高質量3D顯微重建超分辨率免疫熒光分析。
C. 利用金耦聯抗體通過免疫電子顯微鏡檢測E7.5胚胎中DNMT3A和DNMT3B的線粒體定位。
D.在E9.5和E10.5胚胎的純化線粒體中對DNMT3A和DNMT3B進行Western Blot分析。
E-F. 在著床前期選定區域的DNMT3A-mtDNA（E）和DNMT3B-mtDNA（F）物理互作ChIP分析。 G. MeDIP-qPCR檢測野生型、Dnmt3a−/−和Dnmt3b−/− E10.5胚胎的選定區域相對甲基化水平。
（3）DNMT3A和DNMT3B含有促進高效線粒體易位的功能性MTS
C-D. 在E3.5、E7.5和E10.5胚胎中，通過RT-PCR從成熟轉錄本中擴增出能夠編碼DNMT3A（C）和DNMT3B（D）的MTS的瓊脂糖凝膠電泳。
E. 利用預測的DNMT3A和DNMT3B的MTS介導EGFP在線粒體中的轉移，這些EGFP被瞬時轉染到NIH/3T3細胞中。
（4）mtDNA從頭甲基化功能保護線粒體基因組免受氧化損傷。
圖4：mtDNA從頭甲基化保護線粒體基因組免受氧化損傷。
A-B. 在野生型、Dnmt3a−/−和Dnmt3b−/−著床后胚胎中，對長距離區域內（A）和選定區域內（B）的mtDNA損傷進行定量檢測。
C. 線粒體靶向共表達Dnmt3a和Dnmt3b，以及單獨過表達Dnmt3a或Dnmt3b，對NIH/3T3細胞選定區域內相對甲基化水平的影響。
D. 線粒體靶向共表達Dnmt3a和Dnmt3b，以及單獨過表達Dnmt3a或Dnmt3b，對保護NIH/3T3細胞中mtDNA免受H2O2誘導的氧化損傷的影響。
參考文獻：
Yue Y, Ren L, Zhang C, Miao K, Tan K, Yang Q, Hu Y, Xi G, Luo G, Yang M, Zhang J, Hou Z, An L, Tian J. Mitochondrial genome undergoes de novo DNA methylation that protects mtDNA against oxidative damage during the peri-implantation window. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Jul 26;119(30):e2201168119. doi: 10.1073/pnas.2201168119. PubMed PMID: 35858425.
在早期哺乳動物胚胎中，線粒體氧化代謝增強是著床后生存和發育的重要特征；著床前期的線粒體重塑是正常胚胎發生的關鍵事件。在這些變化中，氧化磷酸化（OXPHOS）增強對于支持著床后胚胎的高能量需求至關重要，但線粒體氧化代謝的增強，同時也導致線粒體內大量ROS的積累，由此產生的線粒體氧化應激會破壞早期胚胎線粒體DNA（mtDNA）穩定性。在圍植入期，盡管多種抗氧化機制會被激活以清除細胞內大量的ROS，但線粒體內部是否存在對抗氧化應激的自我保護機制，一直都不清楚。同時線粒體基因組在此過程中發生DNA甲基化，它與線粒體應激增強的時空重合，那mtDNA甲基化是否在維持線粒體基因組穩定性方面發揮作用呢？
近期，中國農業大學動物科學技術學院動物繁殖與發育科學系岳媛博士和任立坤博士為論文共同第一作者、田見暉教授和安磊教授為論文共同通訊在美國科學院院刊（PNAS）正式發表了題為“Mitochondrial genome undergoes de novo DNA methylation that protects mtDNA against oxidative damage during the peri-implantation window“的研究論文，研究揭示了早期胚胎通過線粒體DNA de novo甲基化（de novo mtDNA methylation）保護線粒體基因組穩定性的全新機制。
標題：線粒體基因組經歷從頭DNA甲基化，保護mtDNA在圍植入期免受氧化損傷。
期刊：P NATL ACAD SCI USA（PNAS）
影響因子：IF 9.4 / Q1
本研究團隊發現線粒體基因組經歷了mtDNA從頭甲基化，可以保護mtDNA免受著床前窗口期間氧化增強的損傷。線粒體基因組在在由囊胚向附植后胚胎發育的過程中，發生廣泛的mtDNA甲基化，從而在囊胚的低甲基化狀態中建立相對高甲基化的mtDNA。機制研究表明，DN甲基轉移酶3A（DNMT3A）和DNMT3B在這個過程中進入線粒體并通過特異性線粒體定位序列（MTS）與mtDNA結合。功能喪失和獲得實驗表明，DNMT3A和DNMT3B負責協同催化mtDNA從頭甲基化。最后，通過體內和體外實驗進行驗證，結果證實了增加的mtDNA甲基化功能可以保護線粒體基因組免受線粒體氧化應激增加誘導的mtDNA損傷，維持線粒體基因組穩定性。總的來說，本研究結果揭示了關鍵圍發育期mtDNA甲基化動態及其潛在機制，并揭示了線粒體表觀遺傳重塑與代謝變化之間的功能相關性，證明了核基因組-線粒體在建立線粒體表觀遺傳學和維持線粒體穩態中的作用。
早期胚胎線粒體基因組保護機制模型
結果圖形
（1）著床前期窗口期間mtDNA從頭甲基化與線粒體氧化應激時空重疊。
使用甲基化DNA免疫沉淀測序（MeDIP-seq）分析小鼠E3.5囊胚、E7.5上胚層和E10.5胚胎的mtDNA甲基化模式，這些時間點代表核基因組DNA從頭甲基化的發育窗口。
圖1：著床前窗口期間mtDNA從頭甲基化與線粒體氧化應激的時空重疊。
B. E3.5和E7.5胚胎的線粒體膜電位。右側通過定量紅色(JC-1聚集體)：綠色(JC-1單體)熒光比例來測量線粒體膜電位。
C. MitoSOX(一種特異性線粒體探針)檢測E3.5和E7.5胚胎內線粒體ROS熒光圖像。右側:定量檢測內線粒體ROS水平。
D. MeDIP-seq檢測小鼠線粒體基因組在E3.5、E7.5和E10.5胚胎中的甲基化譜。y軸顯示每500bp MeDIP-reads的歸一化富集。在線性化mtDNA圖譜下方的注釋顯示mtDNA元件的位點。
E. 基于三個發育階段的MeDIP富集評分，對線粒體基因組的所有區間進行熱圖分析。右側：E3.5時不同平均富集評分的三個子類的mtDNA甲基化動態。
F. 具有相對高（≥2.6%，HCP）、中等（>1.2%且<2.6%，ICP）或低（≤1.2%，LCP）CpG密度的三個子類別區間的mtDNA甲基化動態。
G. 在三個發育階段具有不同富集評分的富集區間比例。
H. 使用MeDIP-qPCR檢測著床前期連續發育階段選定區域的相對甲基化水平，包括重鏈和輕鏈蛋白編碼基因（Nd5, Nd6）、非編碼基因（12s）以及調控區域（D-loop）。數據表示三個重復的平均值±標準差。*P < 0.05，**P < 0.01。
(2) DNMT3A和DNMT3B在發育過程中進入到線粒體中并催化mtDNA從頭甲基化。
圖2：DNMT3A和DNMT3B在發育過程中進入到線粒體中并催化mtDNA從頭甲基化。
C. 利用金耦聯抗體通過免疫電子顯微鏡檢測E7.5胚胎中DNMT3A和DNMT3B的線粒體定位。
D.在E9.5和E10.5胚胎的純化線粒體中對DNMT3A和DNMT3B進行Western Blot分析。
E-F. 在著床前期選定區域的DNMT3A-mtDNA（E）和DNMT3B-mtDNA（F）物理互作ChIP分析。 G. MeDIP-qPCR檢測野生型、Dnmt3a−/−和Dnmt3b−/− E10.5胚胎的選定區域相對甲基化水平。
（3）DNMT3A和DNMT3B含有促進高效線粒體易位的功能性MTS
圖3：DNMT3A和DNMT3B含有促進高效線粒體轉移的功能性線粒體定位序列（MTS）。
A-B. DNMT3B（A）和DNMT3A（B）的MTS中代表性α-螺旋結構（紅色）及其相應殘基（紅色文字）的帶狀模型。C-D. 在E3.5、E7.5和E10.5胚胎中，通過RT-PCR從成熟轉錄本中擴增出能夠編碼DNMT3A（C）和DNMT3B（D）的MTS的瓊脂糖凝膠電泳。
E. 利用預測的DNMT3A和DNMT3B的MTS介導EGFP在線粒體中的轉移，這些EGFP被瞬時轉染到NIH/3T3細胞中。
（4）mtDNA從頭甲基化功能保護線粒體基因組免受氧化損傷。
圖4：mtDNA從頭甲基化保護線粒體基因組免受氧化損傷。
C. 線粒體靶向共表達Dnmt3a和Dnmt3b，以及單獨過表達Dnmt3a或Dnmt3b，對NIH/3T3細胞選定區域內相對甲基化水平的影響。
D. 線粒體靶向共表達Dnmt3a和Dnmt3b，以及單獨過表達Dnmt3a或Dnmt3b，對保護NIH/3T3細胞中mtDNA免受H2O2誘導的氧化損傷的影響。
參考文獻：
Yue Y, Ren L, Zhang C, Miao K, Tan K, Yang Q, Hu Y, Xi G, Luo G, Yang M, Zhang J, Hou Z, An L, Tian J. Mitochondrial genome undergoes de novo DNA methylation that protects mtDNA against oxidative damage during the peri-implantation window. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Jul 26;119(30):e2201168119. doi: 10.1073/pnas.2201168119. PubMed PMID: 35858425.
標簽：
DNA甲基化
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