MLKL在激動劑誘導血小板促血栓形成和溶解細胞死亡研究機制詳解
瀏覽次數：1076 發布日期：2024-8-26
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前言：血小板是來源于巨核細胞的無核循環細胞，以其在止血和血栓形成中的核心作用而聞名。盡管血小板通過封閉受傷血管內皮的缺口有助于防止失血，但它們也可能是缺血性中風和心肌梗死等危及生命的血管閉塞性疾病的原因。血小板在誘導劑激活后，經歷強烈的代謝重組并執行能量密集型活動，而未被誘導劑激活的血小板的壽命（人類血小板一般為7-14天）是由血小板凋亡機制所決定的。壞死是一種程序性壞死性凋亡，可被細胞外信號（死亡受體-配體結合）或細胞內誘因（微生物核酸）所誘導。RIPK（受體相互作用絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）1、RIPK3和MLKL（混合譜系激酶結構域樣蛋白）是參與壞死性凋亡的主要分子。MLKL作為RIPK1和RIPK3下游的效應蛋白，是壞死性凋亡的末端效應分子。在壞死性凋亡期間，MLKL被RIPK3磷酸化激活，發生寡聚化，并與磷脂酰肌醇相互作用，誘導膜通透，最終損害細胞膜的完整性，導致細胞死亡。盡管有研究表明，使用巨核細胞（血小板的祖細胞）特異性敲除MLKL的小鼠，其尾部再出血時間延長，激動劑誘導的血小板活化受損；但MLKL在人類血小板中的調節作用在很大程度上仍未被探索。為此，來自印度貝拿勒斯印度教大學（Banaras Hindu University, Varanasi, India）醫學院的科學家于2023年在Nature出版集團旗下期刊《Cell Death & Differentiation》雜志上發表題為《Necroptosis executioner MLKL plays pivotal roles in agonist- induced platelet prothrombotic responses and lytic cell death in a temporal order》的研究論文。
摘要：壞死性凋亡是一種主要由RIPK1、RIPK3和MLKL分子執行的程序性細胞死亡形式。血小板是在止血和病理性血栓形成中發揮核心作用的循環細胞。在這項研究中，作者證明了MLKL在激動劑刺激血小板活化過程中分子作用機制的開創性貢獻，最終在時間尺度上發展為壞死性凋亡。生理激動劑如凝血酶（Thrombin）以RIPK3獨立但磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/AKT依賴的方式刺激血小板中MLKL磷酸化和隨后的寡聚。抑制MLKL顯著抑制了激動劑誘導的血小板止血反應，包括血小板聚集、整合素(αIIbβ3)激活、顆粒分泌、促凝劑(PS)表面生成、細胞內鈣升高、細胞外小泡脫落、血小板-白細胞相互作用和血流剪切力下血栓形成。抑制MLKL也促使受刺激血小板中線粒體氧化磷酸化和有氧糖酵解受損，同時伴有線粒體跨膜電位的破壞、質子泄漏增加、線粒體鈣和ROS下降。這些發現強調了MLKL在維持氧化磷酸化和有氧糖酵解中的關鍵作用，這是能量密集型血小板活化反應的基礎。長時間暴露于凝血酶將引起MLKL寡聚和易位至質膜，導致細胞膜逐漸通透和血小板活力下降，PI3K/MLKL抑制劑可阻止這種情況的發生。總之，MLKL在激動劑誘導的血小板從相對靜止轉變為功能/代謝活躍的促血栓形成以及隨后發展為壞死性調亡方面發揮著至關重要的作用。
結果：盡管血小板是無核細胞，但血小板在能量代謝方面很活躍，其能量代謝系統可以通過有氧糖酵解和線粒體氧化磷酸化供能，使血小板在不同情況下滿足不同功能狀態的能量需求。由于MLKL在激動劑誘導的血小板活化中發揮著關鍵作用，而血小板活化需要消耗大量的能量，那么MLKL對維持血小板高能量代謝狀況的作用又是如何呢？由于大多數人類有核細胞含有數百甚至數千個線粒體，而無核細胞血小板一般僅有5-8個線粒體，血小板含有的線粒體數量相對于常規含核細胞不到1%，這就要求進行線粒體能量代謝檢測時，血小板樣品數量是常規細胞數量的百倍以上，如果線粒體能量代謝檢測方法中樣品孔檢測體積較小時（如只有幾微升檢測體積），就需要花大量時間進行血小板數量梯度摸索，而奧地利Oroboros高精度氧化磷酸化功能表征系統具有0.5-3.5ml大樣品檢測倉體積、樣品無需貼壁處理及快速進行線粒體功能差異表征的技術特點，非常適合檢測含線粒體數量很少的血小板樣品；通過奧地利Oroboros高精度氧化磷酸化功能表征系統對血小板線粒體功能進行表征分析，作者發現用NSA（MLKL抑制劑）預孵育組和未添加NSA的對照血小板（DMSO）組相比，耗氧率（Oxygen Consumption rate）幾乎沒有變化；添加凝血酶（Thrombin）后，發現NSA處理組耗氧率激增量顯著低于DMSO對照組，說明MLKL促進了線粒體電子傳遞的作用；添加寡霉素（Oligomycin，復合體V抑制劑）后，發現NSA處理組耗氧率降低量顯著低于DMSO對照組，表明NSA處理組的氧化磷酸化（OXPHOS）水平顯著低于DMSO對照組，說明在NSA存在的情況下，凝血酶誘導的血小板OXPHOS功能顯著受損；同時也發現添加寡霉素后，NSA處理組質子泄漏（Proton leak）水平顯著高于DMSO對照組，由于質子泄漏代表不依賴于復合體V的質子驅動的氧氣消耗，表明MLKL對線粒體內膜的穩定作用，抑制質子泄漏；以上數據表明MLKL對維持血小板線粒體正常功能運行具有重要作用。
討論：雖然血小板在防止血管損傷時意外失血方面發揮著至關重要的作用，但過度活躍的血小板與急性心肌梗死和缺血性中風等嚴重血栓形成有關。因此，必須徹底了解血小板活化的機制，以設計有效的抗血栓性疾病的治療策略。鑒于MLKL在血小板生理學中的重要作用，它可能是一個治療血栓性疾病的潛在靶點。
參考文獻：Ekhlak, M., Kulkarni, P.P., Singh, V. et al. Necroptosis executioner MLKL plays pivotal roles in agonist-induced platelet prothrombotic responses and lytic cell death in a temporal order. Cell Death Differ 30, 1886–1899 (2023). https://doi.org/10.1038/s41418-023-01181-6.
