腸道微生物群及其研究的重要性
腸道微生物群是指存在于胃腸道中的多樣化微生物群落，它們在調節宿主健康中起著關鍵作用。現代科學研究表明，腸道微生物群的結構和功能變化與多種慢性疾病的發展息息相關，如代謝性疾病、炎癥性腸病和結直腸癌。因此，研究這些微生物群落的遺傳多樣性具有重要意義。近年來，隨著測序技術的進步，科學家們揭示了許多未知微生物的存在，反映出腸道微生物群的復雜性。然而，盡管測序技術提供了大量信息，基于培養的研究依然至關重要，因為它們不僅有助于正確分類和描述新微生物，還為后續的功能研究提供了可能。
 
腸道微生物分離與培養的挑戰
在從復雜菌落中分離和描述微生物的過程中，高效分離單個菌落成員以生成無菌培養物是一個重要步驟。由于人類糞便中的微生物群分布不均，這一過程變得更加復雜。獲得純培養物的傳統方法主要依賴于瓊脂平板上的菌落劃線或連續稀釋過程。在連續稀釋方法中，樣品在微孔板中連續稀釋，直到沒有觀察到細菌生長。雖然這種方法可以產生純培養物，但由于只有一小部分孔能夠產生微生物培養物，因此效率低且產量有限。所以，改進從復雜基質中分離單個細胞的技術，對于提高培養方法的效率至關重要。
 
B.SIGHT：一種高效的單細胞分離方法
為了解決上述問題，我們在此介紹一種快速生成腸道細菌無菌培養物的簡化工作流程。繞過低效的有限稀釋步驟，我們采用專為快速分選單個微生物細胞并直接生成克隆培養物而設計的B.SIGHT系統。B.SIGHT可以將單個微生物細胞分離到液體培養基或固體瓊脂上。這種臺式的系統也可放置在厭氧工作站中，非常適合處理厭氧菌。
  我們使用B.SIGHT系統，成功獲得了1181個大腸桿菌和擬桿菌，以及1666個小鼠腸道細菌的克隆菌群。在最終培養物中，通過MALDI-TOF-MS鑒定了多達500個分離株，揭示了潛在的新物種的存在。此項研究不僅顯著提高了培養方法的效率，還為微生物分類和功能研究奠定了堅實基礎。
 
#材料和方法
 
1. 樣品和培養條件
大腸桿菌和硫化桿菌菌株來源于內部細菌收集。來自小鼠腸道的復合微生物群是由先前生成的混合培養物中獲取的。菌株和樣本在厭氧條件下（89.3% N2, 4.7% H2, 6% CO2）于適當的培養基中進行培養。然后將細胞分配到不同的培養基中（BHI，腦心浸液；WCA，Wilkins-Chalgren厭氧培養基；GMM，腸道微生物培養基）。所有材料和培養基在開始分離工作前24小時放入厭氧工作站。
 
2. B.SIGHT單細胞分離原理
B.SIGHT專為快速、簡單、溫和地分離單菌株而設計，能夠利用高分辨率成像技術進行微生物細胞分離。在實驗中，樣本首先加載到一個墨盒中，然后進入一個直徑為20 µm的噴嘴。當壓電傳感器驅動的活塞推動硅膜時，分配芯片會迅速按需生成小液滴。在操作過程中，對分配芯片噴嘴區域連續成像。檢測軟件會自動分析每個經過的顆粒，確認下一個液滴中是否包含符合參數的單個細胞，只有符合條件的細胞才會被分配到下方的96孔或384孔板的一個孔中。多余的液滴，如空液滴或包含多個細胞的液滴，在分配之前會被真空去除（圖2A）。每個被分配液滴在噴嘴區域采集的圖像都會自動存儲，以便后續驗證單細胞分離的準確性（圖2B）。  
3. 微生物單細胞分離的工作流程
工作流程如圖3所示。在細胞分離之前，將單個細菌菌株或混合菌群在厭氧條件下的液體培養基中培養24小時，以獲得不含腸道內容物碎片且具有足夠密度的細胞懸浮液。接著，將這些培養物在補充有0.5%（w/v）蛋白胨和還原劑的過濾滅菌磷酸鹽緩沖液（PBS）中進行逐級稀釋。最終稀釋液通過10μm膜過濾，并分配（50-70μl）到帶有20μm噴嘴的無菌墨盒中，安裝在B.SIGHT儀器上以進行單細胞分配。B.SIGHT儀器的準備時間通常為5-10分鐘。單細胞被分配到裝有液體或瓊脂培養基的96孔板中。分配后，樣品在37℃下孵育1至7天。液體培養基中的培養物隨后轉移到瓊脂板上進行進一步分析。  
4. MALDI-TOF-MS細菌鑒定
將待鑒定的每個細胞菌落直接點到MALDI靶標上，每個樣本加1μl α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）基質溶液，并在室溫下干燥。最后使用Microflex LT質譜儀（Bruker Daltonics，Germany）進行MALDI-TOF測量。
 
# 結果和討論
 
1. 單一菌株的克隆培養物
本實驗旨在評估單個菌株（每個孔理論上包含一個細胞）在孔板中生長的比例。實驗采用了兼性厭氧菌種大腸桿菌和嚴格厭氧菌種B. vulgatus，以驗證該方法對嚴格厭氧菌的適用性。在實驗中，我們處理了10個96孔板，共獲得800個單細胞孔（每塊板的兩行孔保留為陰性對照：空液滴和培養基各保留一行）。通過OD600吸光度測量，確定了表現出生長的孔的百分比。結果顯示，79.1±4.0%的孔對大腸桿菌呈陽性，68.5±5.3%的孔對B. vulgatus呈陽性（圖4a）。  
2. 從復雜小鼠腸道樣品中分離的單個細菌的鑒定
本實驗通過處理小鼠腸道復雜群落來評估其細菌多樣性。對于樣品1，將單細胞分配到六個固體瓊脂平板和九個液體培養平板上，共計1200個孔。克隆效率即生長孔的比例，達到了87.6%（圖4a）。而樣品2，共使用七個固體瓊脂平板和三個液體培養平板，總計800個孔，單克隆比例為77.8%（圖2a）。孵育后，使用MALDI生物型測定技術對培養物進行鑒定。樣品1的分析結果表明，經處理的465個分離株中至少包含八個不同的物種（圖4b）。樣品2則揭示了620個分離株，至少分屬于12個物種（圖4b）。在兩個樣品中，均發現了與MALDI數據庫不匹配的培養物，可能代表了小鼠腸道微生物群中的未知物種。
 
# 實驗結論
本文介紹了一種高通量培養工作流程，能夠生成大量單克隆培養物用于下游鑒定。B.SIGHT系統在單細胞分配到液體培養基和固體瓊脂上的過程中表現出高度靈活性，并配備圖像確認功能，使整個操作過程更加可靠和可控。
 
B.SIGHT系統占地面積小，能夠方便地放置在厭氧室和層流罩中進行實驗，這進一步增強了其應用范圍和適應性。利用B.SIGHT，已經成功獲得了2800個單克隆的培養物。
 
盡管本文的研究重點是腸道微生物群，但通過適當調整培養條件，這一方法也可以便捷地應用于其他類型的微生物環境。因此，這種高通量培養工作流程被視為研究并培養復雜微生物種群快速且有效的方法，不僅提高了實驗的效率和產出質量，還為多種微生物的研究提供了強大工具，為相關科學研究奠定了堅實基礎。
 
B.SIGHT用戶案例
經典的瓊脂平板（CAP）方法雖然廣泛用于研究微生物群落，但其耗時頗長。相比之下，單細胞分配（SCD）方法則允許高通量、無標記地分選微生物。德國亞琛工業大學研究團隊借助B.SIGHT系統開發了一種新的厭氧SCD方案，用于培養人類腸道細菌，并通過糞便樣本在三種富營養培養基上，與CAP方法進行了對比。實驗結果顯示，新的厭氧SCD方法將單克隆培養物的獲得時間從17天縮短至5天，同時其分離細菌的多樣性和相對豐度在覆蓋率與CAP方法相當。
 
此外，研究團隊還測試了總捕獲部分，對2400個分配的單細胞在生長后直接進行測序，分析未標識單個菌株的體積生物量。結果顯示，SCD方法的培養分數從35.2%提升至52.2%，展示了單樣本在深層培養項目中的潛力。基于SCD的培養還獲得了未檢測到的物種，每個樣本平均發現16種未知微生物，其中包括7個新分類群。
 
此研究覆蓋了5個門（放線菌門、擬桿菌門、脫硫菌門、厚壁菌門和變形菌門）、24個科的82種人類腸道細菌，其中包含11個新屬和10個新物種的第一個培養菌。這為微生物培養和研究提供了新的視角和方法。  
未來展望
B.SIGHT技術在厭氧腸道細菌分離工作中帶來了革命性的變化。憑借其高效、精準和高通量的特性，B.SIGHT不僅顯著提升了研究效率，還為合成生物學和微生物組學的研究開辟了新的可能性。這一突破性工具無疑為相關領域的研究人員提供了充分的便利和潛力。如果您也從事相關領域的研究，B.SIGHT絕對是您值得嘗試的強大工具。它不僅能加速您的研究進展，還能為您提供更為精確和可靠的實驗結果。
 
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