期刊：Nat Commun
影響因子：14.7
主要技術(shù)：mRNA-seq、華大C4

導(dǎo)語(yǔ)
干擾素(IFN)治療慢性乙型肝炎病毒(HBV)的潛在機(jī)制，特別是在低HBsAg和/或年輕患者中，由于缺乏替代治療方法，目前仍未得到解決。通過(guò)CRISPR/ cas9敲入策略，研究了干擾素受體人源化小鼠(huIFNAR小鼠)的基因表達(dá)。證明了人類IFN刺激huIFNAR的PBMCs中的基因表達(dá)譜與人類PBMCs中的基因表達(dá)譜相似，支持了該小鼠模型在體內(nèi)功能分析人類IFN的代表性。揭示了響應(yīng)人類IFN治療的多器官組織特異性基因表達(dá)圖譜；這種模式尚未在健康人體中報(bào)道。最后，通過(guò)AAV-HBV模型測(cè)試人干擾素的抗病毒作用。PEG-IFNα2治療15周可顯著降低HBsAg和HBeAg，甚至實(shí)現(xiàn)HBsAg血清轉(zhuǎn)化。人干擾素對(duì)CD8T細(xì)胞的激活可能是抑制HBsAg的關(guān)鍵。huIFNAR小鼠能夠真實(shí)地響應(yīng)人干擾素刺激，為研究干擾素在體內(nèi)的功能提供了平臺(tái)。PEG-IFNα2治療成功抑制肝內(nèi)HBV復(fù)制，并實(shí)現(xiàn)HBsAg血清轉(zhuǎn)化。

技術(shù)服務(wù)
mRNA-seq、華大C4

研究結(jié)果
1. 人源I型干擾素受體小鼠模型的建立
為了研究人類IFN在小鼠中的作用，設(shè)計(jì)了一個(gè)由人類IFNAR2和IFNAR1組成的串聯(lián)表達(dá)盒，它們由一個(gè)2A序列連接，并將其置于小鼠IFNAR2啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。這兩種小鼠IFNAR1和IFNAR2基因的距離分別位于16號(hào)染色體上（僅130kb），避免了連續(xù)兩輪的基因操作，節(jié)省了時(shí)間。對(duì)于小鼠Ifnar2基因，在ATG起始密碼子旁邊的第2外顯子中插入一個(gè)外源序列，不僅使啟動(dòng)子活性不受干擾，而且在第1外顯子和第2外顯子之間保留了一個(gè)完整的內(nèi)含子，增加了新mRNA的穩(wěn)定性。在3‘端有一個(gè)polyA信號(hào)序列，提供了一個(gè)轉(zhuǎn)錄停止信號(hào)，并導(dǎo)致小鼠IFNAR2的表達(dá)中止。這個(gè)設(shè)計(jì)保持了插入的人IFNAR1和IFNAR2基因的表達(dá)，同時(shí)導(dǎo)致小鼠IFNAR缺陷

在嵌合的huIFNAR中，既可以對(duì)人的IFNα刺激作出反應(yīng)，又可以保證結(jié)合蛋白的募集和下游通路的激活。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR證實(shí)了huIFNAR mRNA的表達(dá)。流式檢測(cè)細(xì)胞表面huIFNAR2蛋白的正常表達(dá)。最后，在體內(nèi)和體外測(cè)試huIFNAR小鼠是否對(duì)人I型干擾素注射有反應(yīng)。人IFNα2處理導(dǎo)致小鼠Mx1（mMx1）和小鼠Isg15（mIsg15）mRNA水平上調(diào)。然而，當(dāng)huIFNAR被抗hR1和/或抗hR2抗體阻斷時(shí)，這種激活作用減弱，這意味著huIFNα2誘導(dǎo)的mMx1和mIsg15表達(dá)的增加是由人源化的I型IFN受體介導(dǎo)的。為檢測(cè)huIFNAR小鼠在體內(nèi)的反應(yīng)，腹腔注射人PEG-IFNα2。在huIFNAR小鼠的PBMCs、肝臟和脾臟中觀察到mMx1和mIsg15 mRNA水平顯著升高，進(jìn)一步證實(shí)了huIFNAR小鼠已成功構(gòu)建，并對(duì)人干擾素刺激有反應(yīng)。通過(guò)WB檢測(cè)脾臟組織中mISG15的表達(dá)。與小鼠IFNα5相比，人PEG-IFNα2誘導(dǎo)的mISG15蛋白水平顯著升高。綜上，作者成功地生成了功能性I型干擾素受體人源化小鼠。
 

Fig 1. I型干擾素受體人源化(huIFNAR)小鼠的產(chǎn)生和功能評(píng)價(jià)

2. Peg-IFNα2刺激huIFNAR小鼠PBMCs中的免疫反應(yīng)與人類PBMCs中類似
使用mRNA測(cè)序比較了小鼠PBMCs和人類PBMCs中受刺激的基因表達(dá)譜。與模擬處理相比，487個(gè)ISG中有199個(gè)有顯著變化。利用每個(gè)huIFNAR PBMCs和人類PBMCs的前5000個(gè)DEGs進(jìn)行KEGG富集分析。PEG-IFNα刺激了huIFNAR PBMCs中109條KEGG通路富集和人PBMCs中146 最顯著富集的BP非常相似。與免疫系統(tǒng)過(guò)程和代謝相關(guān)的變化進(jìn)一步證實(shí)了這種相似性。人Peg-IFNα2誘導(dǎo)的huIFNAR小鼠與人PBMCs的基因反應(yīng)高度相似，表明huIFNAR小鼠可以作為探索人I型干擾素在體內(nèi)功能的替代模型。
 

Fig 2. 小鼠huIFNAR與人PBMCs對(duì)人IFN刺激反應(yīng)的相似性分析

3. 人類IFNα2的組織特異性應(yīng)答圖譜
選擇了9個(gè)主要組織（腦、血、肺、心、肝、脾、腎、肌肉和腸）來(lái)消除體內(nèi)對(duì)人PEGIFNα2刺激的組織特異性反應(yīng)。在不同的組織間觀察到huIFNAR mRNA水平的不同。血液、肝臟和脾臟的huIFNAR表達(dá)水平最高，肌肉、腸道和大腦的表達(dá)水平最低。因此，不同組織對(duì)IFNα2的反應(yīng)有很大差別。血液、肝臟和脾臟在PEGIFNα2刺激下表現(xiàn)出最明顯的圖譜變化。心臟、大腦和腸道的反應(yīng)較微弱。分級(jí)聚類顯示，與血液相比，肝臟中的一個(gè)小基因簇顯著上調(diào)。與肝臟相比，血液中的另一個(gè)基因簇下調(diào)。對(duì)前50個(gè)ISG的變化進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)組織之間在數(shù)量和大小上存在顯著差異，突出表明每個(gè)組織對(duì)干擾素都有獨(dú)特的敏感性。在體內(nèi)全面的組織特異性基因表達(dá)圖譜揭示了對(duì)人類IFNα2刺激反應(yīng)的功能差異性。
 

Fig 3. 響應(yīng)人PEGIFNα2的組織特異性轉(zhuǎn)錄組圖譜

4. 人Peg-IFNα2治療降低了HuIFNAR小鼠中的HBsAg水平
選擇了一個(gè)包含1.3倍HBV基因組（AAV-1.3XHBV）的腺相關(guān)病毒載體，以保證HBV在小鼠中長(zhǎng)期存在。在PEG-IFNα2治療前6周，通過(guò)尾靜脈注射AAV-1.3×HBV。野生型C57BL/6J作為PEG-IFNα2治療對(duì)照。每周檢測(cè)病毒HBsAg、HBeAg和HBV DNA。與野生型小鼠相比，HBV生物標(biāo)志物如HBsAg和HBeAg在早期時(shí)間點(diǎn)存在差異。與預(yù)期的一樣，PEG-IFNα2在C57BL/6J小鼠中未能抑制HBV。相比之下，IFNα治療組的HBsAg從第7周開(kāi)始開(kāi)始下降。從第10周到終止治療，當(dāng)每周使用兩次PEG-IFNα2時(shí)，并沒(méi)有觀察到進(jìn)一步的下降。在終止時(shí)，PEG-IFNα2中的平均血清HBsAg水平約為模擬小鼠的8.04倍。同樣，HBeAg從第9周開(kāi)始下降，但在終止時(shí)僅下降了2.15倍。一只經(jīng)PEG-IFNα2處理的huIFNAR小鼠獲得了HBsAg和HBeAg的丟失，而另一只經(jīng)處理的huIFNAR小鼠在接受PEG-IFNα2治療后，HBsAg顯著減少。在PEG-IFNα2組的6只小鼠中有2只中檢測(cè)到HBsAb。PEG-IFNα2降低肝內(nèi)病毒pgRNA和總mRNA，在#3小鼠中幾乎完全抑制。肝內(nèi)病毒rcDNA結(jié)果顯示，huIFNAR模型中的HBV rcDNA水平比野生型C57BL/6J AAV-HBV模型低一半。
 

Fig 4. 人PEG-IFNα2在huIFNAR AAV-HBV小鼠模型中抑制HBV

5. PEG-IFNα2治療15周后肝內(nèi)免疫細(xì)胞群的改變
對(duì)8856個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，揭示了8個(gè)主要不同的細(xì)胞類型。PEG-IFNα2治療顯示出增加髓系和中性粒細(xì)胞數(shù)量的趨勢(shì)，并減少NK/T和B細(xì)胞數(shù)量。與模擬小鼠相比，在peg-IFNα2處理的小鼠的單核細(xì)胞中，有67個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，16個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。這些差異表達(dá)的基因富集于NF-kappaB信號(hào)通路、toll樣受體信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡和IL-17信號(hào)通路。單核細(xì)胞似乎具有促炎的特性。與模擬治療相比，IFNα2使單核細(xì)胞敏感，使其對(duì)IFN更敏感，增強(qiáng)抗原呈遞，提高共刺激分子表達(dá)，對(duì)免疫細(xì)胞更有吸引力，以及增殖活性。utg1a高的簇更容易對(duì)IFN產(chǎn)生反應(yīng)，而MHCI高的簇顯示出更高的抗原呈遞評(píng)分。trem1高的簇似乎對(duì)IFN的反應(yīng)較弱，趨化因子促炎癥和增殖的得分較高。流式分析顯示，經(jīng)PEG-IFNα2治療后，肝臟中MHCII+ Ly6C+單核細(xì)胞和促炎巨噬細(xì)胞顯著增加。
 

Fig 5. 單細(xì)胞水平干擾素治療15周后肝內(nèi)單核細(xì)胞的特征


Fig 6. 肝內(nèi)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的流式分析

與模擬小鼠相比，NK和NKT細(xì)胞在PEG-IFNα2處理的小鼠中的數(shù)量略有減少，但肝臟常駐NK細(xì)胞的數(shù)量顯著減少。T細(xì)胞在肝臟中富集，但CD4水平不受影響。PEGIFNα2處理組的CD8+ T細(xì)胞顯示出白細(xì)胞粘附、激活和T細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)等功能上調(diào)。整個(gè)CD8+細(xì)胞在活化、趨化因子、細(xì)胞毒性和衰竭方面的得分較高。Lef1+CD8t細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而TeffCD8t細(xì)胞數(shù)量明顯激。肝內(nèi)Teff CD8 T細(xì)胞表現(xiàn)出活化功能、細(xì)胞毒性功能和趨化性功能的增強(qiáng)。Teff CD8 T細(xì)胞也失調(diào)了耗盡特異性基因的表達(dá)，并表現(xiàn)出耗盡的基因表達(dá)譜，表明這些細(xì)胞群的效應(yīng)功能包括衰竭分子的上調(diào)。流式分析還顯示，效應(yīng)記憶CD8+ T（TEM）細(xì)胞顯著增加，CD8+ TEM和總CD8 T細(xì)胞均表達(dá)PD-1水平升高。使用酶聯(lián)免疫吸附點(diǎn)（ELISpot）試驗(yàn)分析了HBV特異性T細(xì)胞的免疫反應(yīng)。用HBV和HBsAg刺激肝內(nèi)淋巴細(xì)胞。測(cè)定分泌的小鼠IFN-γ。但沒(méi)有觀察到HBV特異性T細(xì)胞。總之，在效應(yīng)CD8T細(xì)胞中，衰竭生物標(biāo)志物的共同表達(dá)可能會(huì)降低這些細(xì)胞在體內(nèi)抑制HBV的效力。
 

Fig 7. 單細(xì)胞水平干擾素治療15周后肝內(nèi)CD8+ T細(xì)胞的特征


Fig 8. 肝內(nèi)CD8+ T細(xì)胞的流式分析

參考文獻(xiàn)：
Wang Y, Guo L, Shi J, Li J, Wen Y, Gu G, Cui J, Feng C, Jiang M, Fan Q, Tang J, Chen S, Zhang J, Zheng X, Pan M, Li X, Sun Y, Zhang Z, Li X, Hu F, Zhang L, Tang X, Li F. Interferon stimulated immune profile changes in a humanized mouse model of HBV infection. Nat Commun. 2023 Nov 15;14(1):7393. doi: 10.1038/s41467-023-43078-5IF: 14.7 Q1 . PMID: 37968364; PMCID: PMC10652013.