一、引言
二、siRNA 自身特性的要求
（一）純度與質量

1. 化學純度
   • siRNA 制備過程中應盡量去除雜質，如未完全合成的寡核苷酸、鹽離子、有機溶劑等。高化學純度的 siRNA 能確保其在電轉染過程中與細胞膜及細胞內成分的穩定相互作用，避免雜質對轉染效率的干擾。
   • 例如，采用高效液相色譜（HPLC）等先進的純化技術，可以獲得純度高達 95% 以上的 siRNA，有效提高電轉染效果。
2. 序列特異性
   • siRNA 的序列必須嚴格設計，以確保其特異性地靶向目標基因。避免與其他非靶標基因的同源序列結合，從而減少脫靶效應的發生。
   • 通常，在設計 siRNA 序列時，會利用生物信息學工具進行嚴格篩選，并通過實驗驗證其特異性。

（二）濃度范圍

1. 最佳濃度確定
   • siRNA 的濃度在電轉染實驗中需要進行優化。濃度過低可能導致基因沉默效果不顯著，因為進入細胞內的 siRNA 分子數量不足以有效抑制靶基因的表達。
   • 一般來說，在大多數細胞類型中，siRNA 的濃度范圍在 10 - 100 nM 之間，但不同細胞系和實驗條件下可能有所差異。
2. 濃度過高的影響
   • 過高的 siRNA 濃度可能會引發非特異性的基因沉默或細胞毒性。過多的 siRNA 分子可能會與細胞內的非靶標 RNA 結合，或者干擾細胞的正常生理過程。

三、與電轉染參數的適配性
（一）電場強度適配

1. 避免細胞損傷
   • 電轉染過程中的電場強度需要根據 siRNA 的特性進行調整。過高的電場強度可能會導致細胞膜過度穿孔，使細胞內環境紊亂，影響 siRNA 發揮作用。
   • 例如，對于一些敏感細胞，當電場強度超過 800 V/cm 時，細胞的存活率會顯著降低，同時 siRNA 的轉染效率也會受到影響。
2. 確保有效轉染
   • 合適的電場強度能夠促進細胞膜形成適宜大小和數量的孔隙，便于 siRNA 進入細胞。通常在 200 - 600 V/cm 的電場強度范圍內，siRNA 可以高效地進入細胞。

（二）脈沖寬度與次數的協調

1. 脈沖寬度的影響
   • 脈沖寬度決定了細胞膜孔隙的持續時間。對于 siRNA 轉染，較窄的脈沖寬度（如 1 - 10 μs）可以減少細胞損傷，但可能需要多次脈沖來保證足夠的 siRNA 進入細胞。
   • 例如，在某些實驗中，采用 5 μs 的脈沖寬度，配合 3 - 5 次脈沖，可以在不顯著影響細胞活力的情況下，提高 siRNA 的轉染效率。
2. 脈沖次數的考量
   • 增加脈沖次數可以增加 siRNA 進入細胞的機會，但過多的脈沖次數會對細胞造成累積性損傷。因此，需要在轉染效率和細胞活力之間進行平衡。

四、細胞相關因素的要求
（一）細胞類型與狀態

1. 不同細胞類型的差異
   • 不同的細胞類型對 siRNA 電轉染的敏感性不同。例如，腫瘤細胞與正常細胞在細胞膜組成、細胞內信號通路等方面存在差異，這導致它們對電轉染的參數以及 siRNA 的攝取能力有所不同。
   • 如在某些腫瘤細胞系中，由于細胞膜上特定受體的高表達，可能更容易攝取 siRNA，從而在相對較低的電轉染參數下就能實現較好的基因沉默效果。
2. 細胞生長狀態的影響
   • 處于對數生長期的細胞通常具有較高的活力和較好的細胞膜通透性，更適合進行 siRNA 電轉染實驗。而處于靜止期或衰老期的細胞，其細胞膜結構和細胞內環境可能不利于 siRNA 的攝取和作用。

（二）細胞密度的調節

1. 最佳細胞密度范圍
   • 細胞密度在電轉染實驗中至關重要。過高的細胞密度會導致細胞之間的電場分布不均勻，影響 siRNA 的轉染效率；過低的細胞密度則會降低實驗效率。
   • 一般情況下，細胞密度在 1×10⁶ - 5×10⁶ 個細胞 /mL 范圍內較為適宜，但不同細胞類型和電轉染設備可能需要進行微調。
2. 密度對轉染均勻性的影響
   • 合適的細胞密度可以保證每個細胞在電轉染過程中受到相對均勻的電場作用，從而提高 siRNA 轉染的均勻性和可重復性。

五、實驗環境的要求
（一）緩沖液的選擇

1. 離子強度的影響
   • 電轉染緩沖液的離子強度對 siRNA 轉染效率有顯著影響。合適的離子強度可以穩定細胞膜電位，促進細胞膜穿孔，同時減少細胞損傷。
   • 例如，使用離子強度在 10 - 15 mM 的緩沖液，可以提高 siRNA 在電轉染過程中的穩定性和轉染效率。
2. pH 值與滲透壓的適配
   • 緩沖液的 pH 值應接近細胞的生理 pH（7.2 - 7.4），以保證細胞的正常生理功能和 siRNA 的活性。同時，緩沖液的滲透壓也需要與細胞內環境相匹配，避免細胞吸水或失水。

（二）溫度控制

1. 預冷處理的重要性
   • 在電轉染前，將細胞和 siRNA 混合液在冰上預冷一段時間（如 10 - 15 分鐘）可以降低細胞代謝活性，減少細胞在電轉染過程中的損傷。
2. 轉染過程中的溫度穩定
   • 在電轉染過程中，保持溫度相對穩定也非常關鍵。溫度過高或過低都會影響細胞膜的流動性和孔隙的形成，從而影響 siRNA 的轉染效率。

六、結論