·4分鐘，高通量，40nL樣品，無稀釋，多維質控優化冷凍電鏡樣品·
冷凍電鏡發展難題：不能忽略的樣品制備技術
冷凍電鏡（Cryo-Electron Microscopy）解析生物分子結構在過去的十年間迅速成為結構生物學領域中一種極具吸引力的方法。隨著Cryo-EM的爆炸式普及，樣品制備必須與時俱進，以防止工作流程中斷，導致反復耗時的的實驗過程。

目前，樣品制備已成為工作流程中的主要障礙，部分結構生物學科學家和工程師將研究方向鎖定在解決這一難題上。

隨著研究的樣品越來越異質化和復雜化，研究者需要更繁瑣的優化流程以及更高的研究成本。雖然優化樣品的技術層出不窮，但每種方法的效果因樣品而異。目前，很多樣品優化的結果主要取決于用戶的專業知識和經驗，這一過程可能會變得越來越耗時和具有挑戰性。

樣品優化和負染載網制備過程中會遇到許多變量，尤其是每個流程中都需要對樣品進行稀釋，因此很難確定因果關系。研究人員只能在電鏡下對樣品進行分子水平的評估。雖然一次制備載網的過程不需要太多時間，但為獲得合適的條件而進行的反復試驗卻耗時耗力。從實際情況來看，這使得實驗方案難以標準化。

為了簡化目前的冷凍電鏡樣品制備流程，我們需要一種高通量，快速的，在無稀釋條件下直接表征樣品穩定性的技術手段。FIDA是一種基于第一性原理直接表征分子絕對水動力學半徑的技術，可以實現無稀釋，高通量，多維度表征樣品的穩定性，是全新的樣品質控解決方案。

評估樣品優化參數多，一個完整流程往往需要多種儀器，每個流程中都需要對樣品進行稀釋，很難確定因果關系，導致高成本長時間優化后仍然不能得到完美的冷凍電鏡結果。

英國知名的蛋白質科學服務公司PEAKProtein，使用FIDA對蛋白質進行全面QC分析，相較于傳統QC方法，效率、精度及成本得到全面提升和改善，目前已經將FIDA技術全面應用于冷凍電鏡相關技術的服務流程。實現了對原有采用SDS-PAGE、FSEC、負染的流程進行了優化。
 

FIG1.FIDA的冷凍電鏡解決方案，從小規模構建，放大生產質控與樣品優化全流程都大部分工作可直接通過FIDA完成，尤其是無稀釋的樣品優化，可大大提高得到高質量冷凍電鏡數據成功率。
 

表1：蛋白質量表征技術比較

難題2 影響冷凍電鏡結果質量因素很多，需要在樣品制備與優化時采用多維度數據評估
FIDA技術單次運行只需要40 nL 蛋白質在 4 分鐘內獲得的完整蛋白質 QC 圖，包括冷凍電鏡樣品QC的關鍵參數表征，例如多分散性指數（PDI），聚集（Agg），粘度（Viscosity），粘附性（Stickiness），完整性（R_h）等指標，FIDA是一種非常有效的支持所有生物物理學和結構生物學的基本工具。

其中需要強調的是FIDA不僅可以看到溶液中的蛋白質，還可以看到可溶性和不可溶性聚集體，并可以量化后者，而且可以確定寡聚狀態并實際計算二聚化的 K_d。

FIDA所獲得的R_h為絕對的粒徑大小，可以直接與后期的電鏡數據做比較。此外FIDA內置的 PDB 關聯程序，可以將實際獲得的 R_h 與數據庫中的結構信息進行比較，有助于結構的精細解析。

FIG2. FIDA單次測試的8個質控參數

難題3 膜蛋白難以純化，需要用去垢劑溶解，但有效提取膜蛋白的去垢劑不一定適用于冷凍電鏡，需要高通量快速方法優化膜蛋白增溶條件

納升級樣品高通量膜蛋白的去垢劑增溶條件篩選

FIG3.用40nL的GFP標記的Lac-Y蛋白座位指示劑，采用11種不同去垢劑方案對蛋白溶解程度和PDI指數檢測
 

FIG4.FIDA檢測在11種去垢劑的GFP-LacY熒光信號峰值圖和直方圖

將FIDA檢測的在不同11種去垢劑的GFP-LacY峰值圖信號疊加，其中峰面積代表了溶解蛋白的濃度，將峰值面積整理成直方圖顯示了去垢劑溶解蛋白的能力。

FIG5.11種去垢劑中的GFP-LacY多分散指數（PDI）
 

FIG6.11種去垢劑中的GFP-LacY增溶效果排序

FIDA再根據峰值的形狀計算了了不同去垢劑中蛋白的多分散指數（PDI），可確定樣品是否在去垢劑中呈單分散狀態，這是評估樣品是否適合高質量單粒子冷凍電鏡的關鍵指標。最后綜合樣品在去垢劑中的溶解度和PDI進行對不同組合排序可以得到最優的組合，并且最終結果與FSEC方法一致。

難題4 聚合蛋白低聚條件的條件高通量篩選

FIG7.aSOs-Alexa488樣品在12種添加不同化合物緩沖液中的低聚物與單體比例

FIDA高通量評估在加入12種不同化合物緩沖液中預孵育后，aSOs-Alexa488樣品聚合和單體的Rh和比例，在復合體/聚集體樣品的制備和優化中可評估緩沖液體系是否能維持樣本有活性的聚合狀態。
 

FIG8. 膜蛋白在不同pH值、離子強度、溫度、血漿濃度等條件下篩選

有一些蛋白在冷凍電鏡前需要正確組裝并保證其生物活性，例如一些藥物靶點蛋白，以二聚體或多聚體的形式保持活性狀態，或者某些蛋白復合物分子，很多情況下需要復雜的緩沖液優化或者需要在血漿、配體或細胞裂解液的環境中，這使得我們對樣品制備質控時需要在多條件和復雜條件下對樣品進行評估。

FIDA通過獨有的流體誘導分子擴散原理，可實現對于分子的全面和絕對的質量表征，其極佳的靈敏度和分辨率只需少量的樣品消耗，通過全自動進樣系統實現高通量的無人值守操作。FIDA的第一性原理的單平臺多參數功能極大提升了復雜實驗的產出效率，其對不同樣品的兼容性有望成為一款基礎的結構生物學研究利器。