RNA m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL14在兒童腫瘤進展中的應(yīng)用
神經(jīng)母細(xì)胞瘤（Neuroblastoma, NB）是一種常見的兒童實體瘤，起源于腎上腺區(qū)域的神經(jīng)嵴，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率很高。盡管近年來NB治療取得了顯著進展，提高了生存率，但對于難治性和復(fù)發(fā)性患者，有效的治療選擇仍然有限。因此，全面理解NB風(fēng)險的遺傳變異對于揭示該疾病的潛在原因至關(guān)重要。RNA N6-甲基腺苷（m6A）在基因表達(dá)中的調(diào)控作用引起廣泛關(guān)注，且甲基轉(zhuǎn)移酶樣14（METTL14）對腫瘤進展的作用機制已在各種類型癌癥中得到廣泛研究。但METTL14對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的具體作用仍有待探索。
蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院潘健研究員課題組通過MeRIP-seq和RNA-seq組學(xué)分析揭示了METTL14通過m6A-YTHDF1依賴機制在NB細(xì)胞中抑制YWHAH表達(dá)，促進NB細(xì)胞活性。研究結(jié)果為NB的治療提供了潛在靶點，并為預(yù)后預(yù)測提供了生物標(biāo)志物。相關(guān)研究成果于2024年4月22日以“METTL14 promotes neuroblastoma formation by inhibiting YWHAH via an m6A-YTHDF1-dependent mechanism”發(fā)表在《Cell Death Discovery》期刊。
標(biāo)題：METTL14 promotes neuroblastoma formation by inhibiting YWHAH via an m6A-YTHDF1-dependent mechanism（METTL14通過m6A-YTHDF1依賴性機制抑制YWHAH，從而促進神經(jīng)母細(xì)胞瘤形成）
時間：2024.4.22
期刊：cell death discovery
影響因子：IF 7/ 2區(qū)
實驗方法：MeRIP-seq、RNA-seq、Western blot、qPCR、體外實驗等
研究摘要：
本研究探討了RNA N6-甲基腺苷（m6A）修飾酶METTL14在NB發(fā)展中的作用。研究首先利用TARGET數(shù)據(jù)庫（兒童腫瘤高通量數(shù)據(jù)庫）數(shù)據(jù)揭示了在高風(fēng)險NB患者中METTL14表達(dá)顯著上調(diào)，且與不良預(yù)后有強相關(guān)性。同時，研究鑒定了ETS1和YY1作為調(diào)控METTL14表達(dá)的上游調(diào)控因子。通過體外實驗METTL14敲低，顯著抑制了NB細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在小鼠模型中METTL14敲低可以顯著抑制NB腫瘤形成。通過MeRIP-seq和RNA-seq分析，研究進一步發(fā)現(xiàn)YWHAH是METTL14的下游靶基因。在機制上觀察到甲基化的YWHAH轉(zhuǎn)錄本，特別是在5' UTR區(qū)域中，被m6A“reader”蛋白YTHDF1特異性識別，導(dǎo)致YWHAH mRNA降解。而且YWHAH表達(dá)下調(diào)激活了PI3K/AKT信號通路，促進了NB細(xì)胞活性。總體而言，本研究為METTL14在NB細(xì)胞中的致癌效應(yīng)提供了寶貴見解，突出了其通過m6A-YTHDF1依賴機制抑制YWHAH表達(dá)的作用。這些發(fā)現(xiàn)也提示了生物標(biāo)志物組在NB患者預(yù)后預(yù)測中的潛在應(yīng)用價值。
圖形摘要
研究方法：
結(jié)果圖形：
（1）TARGET數(shù)據(jù)揭示NB患者METTL14過表達(dá)，并且與不良預(yù)后相關(guān)
圖1：m6A甲基化相關(guān)基因在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)、相關(guān)性和預(yù)后信息。
A. 神經(jīng)母細(xì)胞瘤高危組和低危組中m6A甲基化相關(guān)基因的表達(dá)譜。
B. m6A甲基化相關(guān)基因互作差異表達(dá)相關(guān)矩陣。相關(guān)系數(shù)采用負(fù)相關(guān)（藍(lán)色）和正相關(guān)（綠色）繪制。
C. 訓(xùn)練集中9個基因特征的預(yù)后分析。左圖：患者生存狀況；右圖：Kaplan–Meier對10個基因特征的生存分析。
D-E. METTL14在NB中的Kaplan–Meier總體和無事件生存概率分析。
F-G. 神經(jīng)母細(xì)胞瘤MKI和COG組中METTL14的表達(dá)。
H-I. 兩個神經(jīng)母細(xì)胞瘤隊列（GSE45547和GSE120572）中不同時間的METTL14表達(dá)，y軸表示歸一化的log2表達(dá)值。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001和***P<0.0001。
（2）METTL14調(diào)節(jié)NB細(xì)胞活性
B. CCK-8檢測轉(zhuǎn)染了sh-NC或sh-METTL14的NB細(xì)胞增殖。
C. 對SK-N-BE(2)和SK-N-SH細(xì)胞進行EdU染色。圖像顯示DAPI染色的細(xì)胞核（藍(lán)色）和EdU染色的增殖細(xì)胞核（綠色）。
D. 轉(zhuǎn)染了shRNA后的NB細(xì)胞的克隆形成能力減弱。
E. 通過使用PI染色的流式細(xì)胞儀計算細(xì)胞周期分布。
B-C. 在異種移植實驗結(jié)束時（樣本數(shù)n=6），測量了腫瘤體積和重量。
D. 對從異種移植腫瘤中取出的組織切片進行了METTL14和Ki-67表達(dá)的免疫組化(IHC)檢測。
（3）ETS1和YY1調(diào)節(jié)NB細(xì)胞中METTL14表達(dá)
B. 使用兩個隊列GSE49710和GSE45547來分析METTL14與11個轉(zhuǎn)錄因子之間的相關(guān)性。
C. 在NB細(xì)胞中敲低ETS1，并使用qPCR和western blot分析其對METTL14 RNA和蛋白水平的影響。
D. 在神經(jīng)母細(xì)胞瘤高危患者中，ETS1表達(dá)明顯低于低危患者。
E. 對ETS1在NB中的Kaplan-Meier總體生存概率進行分析。
F. 使用CCK-8實驗檢測轉(zhuǎn)染了sh-NC或sh-ETS1的NB細(xì)胞增殖。
G. shRNA轉(zhuǎn)染降低集落形成能力。
H. 檢測轉(zhuǎn)染了sh-NC或sh-ETS1的SK-N-BE(2)和SK-N-SH細(xì)胞的遷移和侵襲能力。所有實驗都進行三次生物學(xué)重復(fù)。
（4）YWHAH是METTL14的下游標(biāo)靶
B. MeRIP-seq結(jié)果顯示，NB細(xì)胞中的m6A修飾位點主要集中在編碼序列（CDS）區(qū)和終止密碼區(qū)。
C. RNA-seq和MeRIP-seq之間存在73個基因重疊。
D. 熱圖顯示20個表達(dá)差異顯著的基因。
E. western blot分析表明METTL14敲低后，YWHAH蛋白水平上調(diào)。
F. MeRIP-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，METTL14敲低后YWHAH在5'端的m6A修飾水平顯著降低。
G. RIP-qPCR結(jié)果表明，METTL14蛋白能夠與YWHAH轉(zhuǎn)錄本結(jié)合。本實驗使用METTL14抗體進行RIP，IgG抗體作為陰性對照。
H. 通過IGV可視化分析，YWHAH基因的m6A修飾水平變化主要發(fā)生在5'非編碼區(qū)。
I. YWHAH的5'非編碼區(qū)有一個高度可能的m6A修飾位點。
J. m6A突變后，熒光素酶活性顯著增加。
K. METTL14敲低后YWHAH轉(zhuǎn)錄本的降解速率顯著降低。
L. 在III期和IV期神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者中，YWHAH表達(dá)顯著增加。（使用兩個隊列GSE45547和GSE49710分析）
M. YWHAH與NB患者的總生存概率存在顯著相關(guān)性。
N. YWHAH和METTL14在NB中的表達(dá)顯示出顯著負(fù)相關(guān)性。
（5）YWHAH通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路作為潛在的腫瘤抑制因子
B. YWHAH過表達(dá)后，收集細(xì)胞進行了克隆形成實驗。
C. 通過CCK-8比色法檢測了過表達(dá)YWHAH的NB細(xì)胞增殖。
D. EdU染色測試以評估YWHAH過表達(dá)對NB細(xì)胞增殖的影響。
E. 分析YWHAH過表達(dá)對NB細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。
F. YWHAH過表達(dá)或METTL14敲低顯著降低了PI3K和AKT的磷酸化水平。
G. METTL14過表達(dá)增加了PI3K/AKT磷酸化水平，而YWHAH過表達(dá)顯著降低了這一磷酸化水平。
H. CCK8檢測顯示，METTL14過表達(dá)能夠增加NB細(xì)胞增殖，而YWHAH過表達(dá)則能顯著降低這種增殖水平。
（6）YTHDF1識別YWHAH的m6A位點
B. NB中YWHAH和YTHDF1的表達(dá)顯示出顯著負(fù)相關(guān)性。
C-E. 在SK-N-BE(2)和SK-N-SH細(xì)胞中進行RNA免疫沉淀(RIP)實驗（C），隨后qPCR檢測顯示METTL14抑制(D)或過表達(dá)(E)后，YTHDF1與NB細(xì)胞中YWHAH mRNA的直接結(jié)合。
F. YTHDF1敲低顯著降低YWHAH mRNA的降解速率。
所有實驗都進行三次重復(fù)。
參考文獻(xiàn)：
Wang J, Yin H, Li G, Wu D, Xu Y, Chen Y, Wang X, Xing Y, Zhang T, Fei D, Yang P, Fang F, Tao Y, Li X, Yu J, Yang Y, Li Z, Shi L, Zhang Z, Pan J. METTL14 promotes neuroblastoma formation by inhibiting YWHAH via an m6A-YTHDF1-dependent mechanism. Cell Death Discov. 2024 Apr 22;10(1):186. pii: 10.1038/s41420-024-01959-8. doi: 10.1038/s41420-024-01959-8. PubMed PMID: 38649363.
蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院潘健研究員課題組通過MeRIP-seq和RNA-seq組學(xué)分析揭示了METTL14通過m6A-YTHDF1依賴機制在NB細(xì)胞中抑制YWHAH表達(dá)，促進NB細(xì)胞活性。研究結(jié)果為NB的治療提供了潛在靶點，并為預(yù)后預(yù)測提供了生物標(biāo)志物。相關(guān)研究成果于2024年4月22日以“METTL14 promotes neuroblastoma formation by inhibiting YWHAH via an m6A-YTHDF1-dependent mechanism”發(fā)表在《Cell Death Discovery》期刊。
標(biāo)題：METTL14 promotes neuroblastoma formation by inhibiting YWHAH via an m6A-YTHDF1-dependent mechanism（METTL14通過m6A-YTHDF1依賴性機制抑制YWHAH，從而促進神經(jīng)母細(xì)胞瘤形成）
時間：2024.4.22
期刊：cell death discovery
影響因子：IF 7/ 2區(qū)
實驗方法：MeRIP-seq、RNA-seq、Western blot、qPCR、體外實驗等
研究摘要：
本研究探討了RNA N6-甲基腺苷（m6A）修飾酶METTL14在NB發(fā)展中的作用。研究首先利用TARGET數(shù)據(jù)庫（兒童腫瘤高通量數(shù)據(jù)庫）數(shù)據(jù)揭示了在高風(fēng)險NB患者中METTL14表達(dá)顯著上調(diào)，且與不良預(yù)后有強相關(guān)性。同時，研究鑒定了ETS1和YY1作為調(diào)控METTL14表達(dá)的上游調(diào)控因子。通過體外實驗METTL14敲低，顯著抑制了NB細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在小鼠模型中METTL14敲低可以顯著抑制NB腫瘤形成。通過MeRIP-seq和RNA-seq分析，研究進一步發(fā)現(xiàn)YWHAH是METTL14的下游靶基因。在機制上觀察到甲基化的YWHAH轉(zhuǎn)錄本，特別是在5' UTR區(qū)域中，被m6A“reader”蛋白YTHDF1特異性識別，導(dǎo)致YWHAH mRNA降解。而且YWHAH表達(dá)下調(diào)激活了PI3K/AKT信號通路，促進了NB細(xì)胞活性。總體而言，本研究為METTL14在NB細(xì)胞中的致癌效應(yīng)提供了寶貴見解，突出了其通過m6A-YTHDF1依賴機制抑制YWHAH表達(dá)的作用。這些發(fā)現(xiàn)也提示了生物標(biāo)志物組在NB患者預(yù)后預(yù)測中的潛在應(yīng)用價值。
圖形摘要
研究方法：
結(jié)果圖形：
（1）TARGET數(shù)據(jù)揭示NB患者METTL14過表達(dá)，并且與不良預(yù)后相關(guān)
圖1：m6A甲基化相關(guān)基因在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)、相關(guān)性和預(yù)后信息。
B. m6A甲基化相關(guān)基因互作差異表達(dá)相關(guān)矩陣。相關(guān)系數(shù)采用負(fù)相關(guān)（藍(lán)色）和正相關(guān)（綠色）繪制。
C. 訓(xùn)練集中9個基因特征的預(yù)后分析。左圖：患者生存狀況；右圖：Kaplan–Meier對10個基因特征的生存分析。
D-E. METTL14在NB中的Kaplan–Meier總體和無事件生存概率分析。
F-G. 神經(jīng)母細(xì)胞瘤MKI和COG組中METTL14的表達(dá)。
H-I. 兩個神經(jīng)母細(xì)胞瘤隊列（GSE45547和GSE120572）中不同時間的METTL14表達(dá)，y軸表示歸一化的log2表達(dá)值。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001和***P<0.0001。
（2）METTL14調(diào)節(jié)NB細(xì)胞活性
圖2：METTL14敲低抑制了NB細(xì)胞在體外的存活和增殖。
A. western blotting分析SK-N-BE(2)和SK-N-SH細(xì)胞的METTL14表達(dá)。內(nèi)部參照標(biāo)準(zhǔn)是GAPDH。B. CCK-8檢測轉(zhuǎn)染了sh-NC或sh-METTL14的NB細(xì)胞增殖。
C. 對SK-N-BE(2)和SK-N-SH細(xì)胞進行EdU染色。圖像顯示DAPI染色的細(xì)胞核（藍(lán)色）和EdU染色的增殖細(xì)胞核（綠色）。
D. 轉(zhuǎn)染了shRNA后的NB細(xì)胞的克隆形成能力減弱。
E. 通過使用PI染色的流式細(xì)胞儀計算細(xì)胞周期分布。
圖3：METTL14敲低可以抑制體內(nèi)腫瘤形成。
A. 通過皮下注射sh-NC或sh-METTL14轉(zhuǎn)染的SK-N-BE(2)細(xì)胞形成的異種移植腫瘤照片。B-C. 在異種移植實驗結(jié)束時（樣本數(shù)n=6），測量了腫瘤體積和重量。
D. 對從異種移植腫瘤中取出的組織切片進行了METTL14和Ki-67表達(dá)的免疫組化(IHC)檢測。
（3）ETS1和YY1調(diào)節(jié)NB細(xì)胞中METTL14表達(dá)
圖4：鑒定ETS1作為METTL14的潛在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。
A. 使用AnimalTFDB3和JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測可能與METTL14啟動子序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)了11個更有可能的轉(zhuǎn)錄因子，如ETS1、SPI1、GATA2和YY1。B. 使用兩個隊列GSE49710和GSE45547來分析METTL14與11個轉(zhuǎn)錄因子之間的相關(guān)性。
C. 在NB細(xì)胞中敲低ETS1，并使用qPCR和western blot分析其對METTL14 RNA和蛋白水平的影響。
D. 在神經(jīng)母細(xì)胞瘤高危患者中，ETS1表達(dá)明顯低于低危患者。
E. 對ETS1在NB中的Kaplan-Meier總體生存概率進行分析。
F. 使用CCK-8實驗檢測轉(zhuǎn)染了sh-NC或sh-ETS1的NB細(xì)胞增殖。
G. shRNA轉(zhuǎn)染降低集落形成能力。
H. 檢測轉(zhuǎn)染了sh-NC或sh-ETS1的SK-N-BE(2)和SK-N-SH細(xì)胞的遷移和侵襲能力。所有實驗都進行三次生物學(xué)重復(fù)。
（4）YWHAH是METTL14的下游標(biāo)靶
圖5：YWHAH是METTL14的下游靶基因。
A. METTL14敲低后，NB細(xì)胞的整體m6A水平顯著下降。B. MeRIP-seq結(jié)果顯示，NB細(xì)胞中的m6A修飾位點主要集中在編碼序列（CDS）區(qū)和終止密碼區(qū)。
C. RNA-seq和MeRIP-seq之間存在73個基因重疊。
D. 熱圖顯示20個表達(dá)差異顯著的基因。
E. western blot分析表明METTL14敲低后，YWHAH蛋白水平上調(diào)。
F. MeRIP-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，METTL14敲低后YWHAH在5'端的m6A修飾水平顯著降低。
G. RIP-qPCR結(jié)果表明，METTL14蛋白能夠與YWHAH轉(zhuǎn)錄本結(jié)合。本實驗使用METTL14抗體進行RIP，IgG抗體作為陰性對照。
H. 通過IGV可視化分析，YWHAH基因的m6A修飾水平變化主要發(fā)生在5'非編碼區(qū)。
I. YWHAH的5'非編碼區(qū)有一個高度可能的m6A修飾位點。
J. m6A突變后，熒光素酶活性顯著增加。
K. METTL14敲低后YWHAH轉(zhuǎn)錄本的降解速率顯著降低。
L. 在III期和IV期神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者中，YWHAH表達(dá)顯著增加。（使用兩個隊列GSE45547和GSE49710分析）
M. YWHAH與NB患者的總生存概率存在顯著相關(guān)性。
N. YWHAH和METTL14在NB中的表達(dá)顯示出顯著負(fù)相關(guān)性。
（5）YWHAH通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路作為潛在的腫瘤抑制因子
圖6：YWHAH過表達(dá)通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞活性。
A. 通過Western Blot（WB）檢測NB細(xì)胞中的YWHAH蛋白過表達(dá)。B. YWHAH過表達(dá)后，收集細(xì)胞進行了克隆形成實驗。
C. 通過CCK-8比色法檢測了過表達(dá)YWHAH的NB細(xì)胞增殖。
D. EdU染色測試以評估YWHAH過表達(dá)對NB細(xì)胞增殖的影響。
E. 分析YWHAH過表達(dá)對NB細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。
F. YWHAH過表達(dá)或METTL14敲低顯著降低了PI3K和AKT的磷酸化水平。
G. METTL14過表達(dá)增加了PI3K/AKT磷酸化水平，而YWHAH過表達(dá)顯著降低了這一磷酸化水平。
H. CCK8檢測顯示，METTL14過表達(dá)能夠增加NB細(xì)胞增殖，而YWHAH過表達(dá)則能顯著降低這種增殖水平。
（6）YTHDF1識別YWHAH的m6A位點
圖7：YTHDF1以m6A依賴性方式促進YWHAH mRNA衰變。
A. YTHDF1敲低后，YWHAH蛋白水平上調(diào)。B. NB中YWHAH和YTHDF1的表達(dá)顯示出顯著負(fù)相關(guān)性。
C-E. 在SK-N-BE(2)和SK-N-SH細(xì)胞中進行RNA免疫沉淀(RIP)實驗（C），隨后qPCR檢測顯示METTL14抑制(D)或過表達(dá)(E)后，YTHDF1與NB細(xì)胞中YWHAH mRNA的直接結(jié)合。
F. YTHDF1敲低顯著降低YWHAH mRNA的降解速率。
所有實驗都進行三次重復(fù)。
參考文獻(xiàn)：
Wang J, Yin H, Li G, Wu D, Xu Y, Chen Y, Wang X, Xing Y, Zhang T, Fei D, Yang P, Fang F, Tao Y, Li X, Yu J, Yang Y, Li Z, Shi L, Zhang Z, Pan J. METTL14 promotes neuroblastoma formation by inhibiting YWHAH via an m6A-YTHDF1-dependent mechanism. Cell Death Discov. 2024 Apr 22;10(1):186. pii: 10.1038/s41420-024-01959-8. doi: 10.1038/s41420-024-01959-8. PubMed PMID: 38649363.
標(biāo)簽：
RNA甲基化
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