共價抑制劑最早可追溯到 17 世紀末的非甾體抗炎藥 Aspirin (阿司匹林)。相較于非共價藥物，共價藥物的優勢在于能夠提高藥物效力，延長靶向結合時間，選擇性更強，同時可以靶向某些“不可成藥” 靶點，解決耐藥性問題。

越來越多的研究表明，許多已上市的藥物都是通過共價作用發揮其藥效，近年來一些共價蛋白激酶抑制劑的成功上市，如 Ibrutinib  (BTK 共價抑制劑) 和 Dacomitinib  (EGFR 共價抑制劑)，更是讓共價藥物成為了藥物開發中一個備受關注的領域[1]。

圖 1. 共價藥物的開發歷程^[1]。 

在過去的共價藥物的研究歷史中，共價藥物主要是來源自偶然發現。盡管最早的共價藥物阿司匹林上市于 1899 年，但直到 1971 年阿司匹林的共價作用機制才被揭開。

阿司匹林中的活性成分乙酰水楊酸共價結合環氧合酶 (COX-1 和 COX-2)，將其乙酰基轉移到 COX 的絲氨酸側鏈的羥基上，抑制花生四烯酸（環氧合酶的底物）轉化為前列腺素，以發揮抗炎作用。青霉素類抗生素是另一類共價抑制劑，后面被發現其機制是基于青霉素 β-內酰胺類化合物與青霉素結合蛋白 1B 的活性位點絲氨酸共價結合[2]。


圖 2. (a-c) 阿司匹林和 (d-e) 青霉素的共價作用機制圖^[2]。

由此可見，之前的共價藥物都不是刻意設計的，大多數來自于天然產物，其共價機制更是在臨床上被廣泛使用后才被闡明。由于共價化合物在過去被認為可能帶來脫靶效應，并且誘發一些免疫反應從而存在潛在的安全問題，因此當時大多數醫藥公司都會優先考慮非共價化合物，直到后期越來越多藥物的共價機制被披露，共價化合物才開始被藥物開發人員重視起來。迄今為止，共價抑制劑更是占據了上市藥物約 30% 的比例。

傳統的小分子藥物設計是基于抑制或激活生物靶標的生物活性從而發揮作用。無論小分子藥物的功能如何，其作用通常取決于活性物質 (如抑制劑、效應劑或激活劑) 與生物靶標 (如酶、蛋白質、離子通道或受體) 之間的相互作用。
 Tips：
共價藥物與靶標發生共價結合主要分為兩個過程：(1) 共價藥物的親電彈頭通過靠近生物靶標的活性氨基酸殘基，與生物靶標可逆性結合。(2) 共價藥物與生物靶標發生反應以形成共價鍵。

根據反應的可逆性，共價藥物可以被分為可逆型共價藥物和不可逆型共價藥物。可逆性共價藥物在設計上旨在提高藥物的安全性和選擇性，而不可逆性共價藥物則提供了更持久的藥理作用，但需要更仔細地考慮其潛在的脫靶效應和毒性風險，建議大家謹慎選擇哦~

丙烯酰胺、β-內酰胺等親電彈頭是共價藥物發揮作用的結構基礎，親電彈頭能與靶蛋白中特定的氨基酸殘基 (如半胱氨酸、絲氨酸或蘇氨酸等) 發生化學反應，形成共價鍵，從而抑制靶標蛋白的生物學功能。目前為止，已有幾十種的親電彈頭被發現，其中在上市和待批準藥物中以“丙烯酰胺類彈頭”開發的共價藥物數量最多[3]。

生物靶點的識別和驗證是藥物發現的第一步，接下來是對鑒定出的苗頭化合物進行表征和結構優化。共價藥物發現中使用的許多方法與傳統藥物化學中使用的方法相似，包括高通量篩選、虛擬篩選和合理的藥物設計等。然而，在共價藥物的設計中，很多地方都是獨一無二的 (如靶點選擇、親電彈頭和氨基酸殘基的選擇等)。因此，共價藥物的設計一般包含四個過程：靶標識別和氨基酸殘基選擇；苗頭化合物的識別；結合表征；結構優化[4]。

圖 3. 共價藥物設計的階段圖^[4]。 
▐  靶標識別及氨基酸殘基的選擇
治療靶標的識別是共價藥物設計的第一步，往往基于遺傳學、生物物理學、化學物理學或其他原理的方法進行。通常，疾病靶點應當作為藥物設計的第一指導原則，在開展藥物開發工作前，確認疾病-靶點的關聯度非常重要。
目前，基于活性的蛋白質分析 (Activity-based protein profiling, ABPP) 是用于共價化合物靶點發現最通用的化學蛋白質組學方法之一，通過反應性共價片段來確定共價作用的可能靶點。初步篩選出可能的靶點后，還需要對藥物靶標進行驗證，目的是通過調節靶標來驗證其對疾病的治療作用，為靶點的“二次鑒定”提供依據。

在共價藥物的設計中，氨基酸殘基的選擇同樣尤為重要。在設計共價藥物時必須考慮共價彈頭和氨基酸殘基的反應性。此外，還需要考慮該生物靶點是否適合共價機制，以避免潛在的藥物毒性，同時還需要滿足藥物的高選擇性。在各類氨基酸殘基中，半胱氨酸是最為常見的共價氨基酸殘基，其代表藥物有奧美拉唑、氯吡格雷、阿法替尼等[5]。

圖 4. 常見的共價氨基酸殘基結構^[4]。
▐  苗頭化合物的識別
高通量篩選 (High-throughput screen，HTS) 是藥物設計中常用技術之一，用于從化合物庫中發現可能成為藥物化學優化的先導化合物，可以加速大批量化合物的篩選進程。對于已知共價抑制劑及具有共價反應基團的活性小分子化合物，可以直接使用 HTS 對其進行藥物篩選。

在共價藥物設計中，基于片段的藥物發現 (Fragment-based Drug Discovery，FBDD) 是一種較為廣泛應用的方法。FBDD 適用于篩選分子量更小、結構不太復雜的分子，通過篩選出有活性的片段后，將不同片段進行組合延伸以到新的藥物分子。由于片段化合物庫范圍更廣，因此篩選出活性化合物的概率更大。并且片段具有分子量小、無效基團少的特點，后期更有利于進行結構優化[6]。例如 BTK 抑制劑 TAK-020  (一種臨床前候選藥物) 就是基于 FBDD 發現的[7]。

圖 5. 基于 FBDD 的臨床候選藥物 TAK-020^[7]。

此外，DNA 編碼化合物庫 (DNA Encoded compound Library，DEL) 技術也是一種共價藥物的篩選方法，與 HTS 和 FBDD 相比，DEL 最顯著的優勢在于能夠篩選更大的文庫，可達到千萬甚至數十億級別的數量[8]。在 2020 年的疫情期間，Rui Ge 等就基于 DEL 技術，構建了具有 6 億個化學結構的 DNA 編碼文庫，針對冠狀病毒中的半胱氨酸蛋白酶 Mpro 進行了共價抑制劑的篩選[9]。

▐  結合表征
藥物的表征是藥物發現過程中的關鍵步驟，傳統的表征參數包括解離常數、IC₅₀、EC₅₀ 等。而共價藥物的主要表征方法有：體外生物活性測定、質譜分析、時間分辨熒光共振能量轉移技術 (TR-FRET)、表面等離子體共振 (SPR) 技術等。事實上，表征參數及表征方法的選擇不能一概而論，需要根據藥物的本身特性去進行選擇。
▐  結構優化
在確定了苗頭化合物后，我們往往需要對化合物的結構進行進一步優化，目的是改善其藥物代謝動力學性質，增強共價彈頭的選擇性，避免脫靶效應，增強藥物的作用時間等。最終經過結構優化后，就可以得到先導化合物。 

在過去的十年中，共價藥物在新藥開發領域取得了顯著進展，這主要得益于對共價作用機制的深入理解以及藥物開發技術的持續創新。為了加速共價藥物領域的發展，MCE 精心設計了多種化合物庫，如共價化合物庫、半胱氨酸靶向共價化合物、半胱氨酸靶向片段庫、DNA 編碼化合物庫等。這些化合物庫不僅能夠為共價藥物的開發提供一定幫助，也是研究共價作用機制的重要工具。

[1] Boike L, et al. Advances in covalent drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 2022;21(12):881-898. 
[2] Ghosh AK, et al. Covalent Inhibition in Drug Discovery. ChemMedChem. 2019 May 6;14(9):889-906. 
[3] Ray S, et al. New Electrophiles and Strategies for Mechanism-Based and Targeted Covalent Inhibitor Design. Biochemistry. 2019;58(52):5234-5244.
[4] Zheng L, et al. Development of covalent inhibitors: principle, design and application in cancer. MedComm – Oncology. 2023; 2:e56. 
[5] Huang F, et al. Covalent Warheads Targeting Cysteine Residue: The Promising Approach in Drug Development. Molecules. 2022;27(22):7728.
[6] Bon M, et al. Fragment-based drug discovery-the importance of high-quality molecule libraries. Mol Oncol. 2022;16(21):3761-3777.
[7] Sabat M, et al. Discovery of the Bruton's Tyrosine Kinase Inhibitor Clinical Candidate TAK-020 (S)-5-(1-((1-Acryloylpyrrolidin-3-yl)oxy)isoquinolin-3-yl)-2,4-dihydro-3H-1,2,4-triazol-3-one, by Fragment-Based Drug Design. J Med Chem. 2021 Sep 9;64(17):12893-12902. 
[8] Li L, et al. Triazine-Based Covalent DNA-Encoded Libraries for Discovery of Covalent Inhibitors of Target Proteins. ACS Med Chem Lett. 2022;13(10):1574-1581. 
[9] Ge R, et al. Discovery of SARS-CoV-2 main protease covalent inhibitors from a DNA-encoded library selection. SLAS Discov. 2022 Mar;27(2):79-85.