超高速視頻級原子力顯微鏡實時成像研究膜蛋白的形成過程和轉運機制
應用案例（超高速視頻級原子力顯微鏡-HS-AFM）：“眼見為實”超高速視頻級原子力顯微鏡實時成像研究膜蛋白的形成過程和轉運機制
翻譯整理：北京佰司特科技有限責任公司
超高速視頻級原子力顯微鏡（High-Speed Atomic Force Microscope，HS-AFM）由日本 Kanazawa 大學 Prof. Ando 教授團隊研發，日本RIBM公司（生體分子計測研究所株式會社，Research Institute of Biomolecule Metrology Co., Ltd）商業化的產品，可以達到視頻級成像的商業化原子力顯微鏡。HS-AFM突破了傳統原子力顯微鏡“掃描成像速慢”的限制，能夠在液體環境下超快速動態成像，分辨率為納米水平。樣品無需特殊固定，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動態觀測。超高速視頻級原子力顯微鏡HS-AFM主要有兩種型號，SS-NEX樣品掃描（Sample-Scanning HS-AFM）以及PS-NEX探針掃描（Probe-Scanning HS-AFM）。推出至今，全球已有100多位用戶，發表 SCI 文章 300 余篇，包括Science, Nature, Cell 等頂級雜志。翻譯整理：北京佰司特科技有限責任公司
相較于目前市場上的原子力顯微鏡成像設備，HS-AFM突破了 “掃描成像速慢”的限制，掃描速度高可達 20 frame/s，并且有 4 種掃描臺可供選擇。樣品無需特殊固定染色，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動態觀測。液體環境下直接檢測，超快速動態成像，分辨率為納米水平。探針小，適用于生物樣品；懸臂探針共振頻率高，彈簧系數小，避免了對生物樣品等的損傷。懸臂探針可自動漂移校準，適用于長時間觀測。采用動態PID控制，高速掃描時仍可獲得清晰的圖像。XY軸分辨率2nm；Z軸分辨率0.5nm。
HS-AFM不僅擁有超高掃描速率與原子級別分辨率，而且具有操作的簡易性，使得對單分子動態過程的捕捉變得十分方便，為科研工作者研所和理解生物物理、生物化學、分子生物學、病毒學以及生物醫學等領域的單分子動態過程提供了一款強大的工具。
全新的HS-AFM采用了新的高頻微懸臂架構，更低噪音、更高穩定性的2控制器，高速掃描器，緩沖防震設計，主動阻尼，動態PID，驅動算法優化，多種前沿技術，可以實現在超高速下獲取高分辨的生物樣品信息。新系統整合了基于工作流程的操作軟件，直觀的用戶界面與流程化、自動化的設置使得研究人員可以專注于實驗設計，不需要復雜的操作和條件設置，快速獲取數據，加速研究的產出。
1）膜蛋白的結構形成過程研究
成孔毒素（Pore-forming toxin, PFT）能在靶細胞膜上寡聚化形成穿膜通道, 破壞細胞膜結構并使其滲透性增強而導致細胞滲透性溶解。 PFT寡聚體在細胞膜上可以連接形成密排六方結構（hcp）。
Lysenin是來源于蚯蚓的一種PFT，可在鞘磷脂/膽固醇（SM/chol）雙層膜結構中寡聚化并形成hcp。實驗中，研究人員使用了日本RIBM的超高速視頻原子力顯微鏡（HS-AFM），對SM/chol雙層膜結構中lysenin寡聚體組裝成hcp的動態過程進行了實時成像，發現了hcp結構形成的規律。
研究人員將lysenin與SM/chol雙層膜結構在云母為基底的環境下共同培養后使用HS-AFM進行成像。下圖顯示了lysenin寡聚體形成的hcp在膜結構上的分布。白色六邊形表示一個hcp單元，箭頭表示未完全形成的寡聚體。通過計算可以獲得Hcp單元的間距和寡聚體直徑等數據，與之前使用電鏡的研究獲得的數據一致。
通過HS-AFM還可以獲得lysenin寡聚體的三維圖像。對各個寡聚體的高度數據進行統計，可以發現高度分布主要為兩種，高度較低的寡聚體已經嵌入了膜結構中，并可能形成了核孔。
接下來研究人員對400×300nm區域內的SM/chol雙層膜結構上的lysenin組裝過程進行了動態成像。圖A展示了lysenin簇的形成并可以檢測簇的增長方向（圖B），終組裝形成hcp結構。
在黑色的云母基底上也能觀察到lysenin，分析雙層膜結構上和基底上的lysenin半徑大小可以得出，雙層膜結構上的lysenin形成了寡聚體進而組成hcp結構，而基底上的lysenin處于單體或不規則聚集形態，無法形成寡聚體，這也與之前的研究結果一致。
對視野內的lysenin簇如B圖進行劃分并進一步分析可以得出：
1. Lysenin形成單個簇后，在雙層膜上水平擴散，聚集排列形成hcp結構；
2. 新形成的簇會組成新的矩形排列（彩色矩形）或填充到已有的矩形排列的空缺處，有些已經形成的簇會在膜上擴散或分解；
3. 矩形排列的方向可變（如上方紅色矩形）；
4. 絕大多數Lysenin簇在裝配開始就會聚集形成簇，而不是隨機分布在膜上。
HS-AFM還可以在更高的放大倍數下以更高速率成像，以實現對lysenin簇組裝成hcp結構的動態進行更詳細的檢測。
通過對結果的分析可以得出，大部分從外圍結合到hcp結構區域的簇會以平均0.45秒的時間分解，而已經形成hcp結構的則相對更加穩定，可能原因是內部的lysenin寡聚體相互之間具有更多的結合位點，更難以分解。
小結：高速AFM成像可用于lysenin形成hcp結構的動態過程的研究。lysenin簇于膜上形成，經過大量的分解\重組和擴散形成hcp結構，隨著膜上hcp數量的增多而趨向于穩定。同時，我們還可以獲得簇的高度信息，用于表征lysenin與膜的結合以及穿膜通道的形成。
2）膜蛋白的結構形成機制研究
膜聯蛋白（Annexin）是于真核細胞的細胞質內普遍存在的一種蛋白，與多種細胞膜功能相關，如胞吞、胞吐以及離子轉運等。膜聯蛋白在鈣離子環境下可結合至磷脂，進行細胞膜修復等作用，但至今對于膜聯蛋白-鈣離子-磷脂三者的組裝與分解的動態過程的研究仍處于空白。
這項研究中，研究人員使用日本RIBM的超高速視頻原子力顯微鏡（HS-AFM）引導了膜聯蛋白V（A5）的組裝與分解并進行成像，分析了過程中的蛋白結構，動力學和分子間相互作用。
研究人員先將雙層脂膜加入含2mM鈣離子的緩沖液，再加入A5并用HS-AFM成像。可以觀察到A5三聚體在膜上形成了六邊形晶格結構（標記1），并在中間含有縱向高度更低的三聚體（標記2）或者空洞（標記3），這與先前使用其他AFM和電鏡的結果相一致。
HS-AFM可以進行每秒幾十幀的更高速度的成像。對上圖中標記2的區域進行高速成像，三聚體依然保持了相似的尺寸和高度。在高速成像下，研究人員次發現三聚體的方向會發生變化：向上（0°）和向下（60°）。此A5三聚體與其他形成了六邊形晶格結構的三聚體相比，分子間相互作用更弱，使其能夠改變方向。
傳統的AFM和電鏡獲得的圖像是時間或空間的平均圖像，無法記錄短時間內的變化，因此難以發現三聚體方向的改變。通過HS-AFM的高速實時成像才發現并捕捉到了這一現象。
HS-AFM還可以與微流系統和激光等其他儀器結合，在實驗過程中對樣品和環境進行更多操作并實時成像，可以對兩種A5三聚體的組裝與分解進行更加深入、詳細的研究。
研究人員使用微流系統可向實驗環境加入EDTA,可以降低鈣離子含量，使三聚體形成的晶格結構分解，同時，通過控制的流量可以地計算出加入EDTA的含量進行定量分析；整合的高精度紫外激光，可以對鈣離子籠鎖化合物進行解籠鎖操作，使其在實驗過程中可以多次反復釋放鈣離子。
起初，我們可以清晰地觀察到晶格結構；277s時緩慢加入40mM EDTA后，晶格結構分解；441s時啟動紫外激光，解籠鎖發生釋放出鈣離子，晶格結構重新組裝；870s時關閉激光，晶格結構再次開始分解。
進一步提高放大倍數后進行高分辨率成像，可以發現加入EDTA后，非六邊形晶格的A5三聚體相對于形成了六邊形晶格結構的三聚體分解更快，對于鈣離子含量下降更加敏感。
小結：通過HS-AFM的高速、高分辨率成像以及與其他儀器的聯用，在體外構建了實時生化反應環境，在對蛋白結構直接成像的同時，發現了構成膜聯蛋白結構的兩種不同狀態的蛋白三聚體的差異，同時證明了鈣離子在蛋白組裝過程中的必要性。
3）膜蛋白的跨膜運動機制研究
谷氨酸鹽跨膜轉運蛋白（GltPh）的主要作用是通過跨膜轉運谷氨酸鹽，將突觸間隙的谷氨酸鹽濃度保持在興奮性毒性以下，防止神經元死亡導致神經系統疾病如癲癇、老年癡呆等。
GltPh如右圖所示，由一個固定在膜上的三聚體結構域（橙色）和一個轉運結構域（藍色）組成。在有鈉離子和谷氨酸的環境下，轉運結構域可移動至膜的對側來轉運谷氨酸鹽；在無基底的環境下，轉運結構域也可以跨膜移動。
之前，GltPh的直接動態成像很難實現，RIBM的超高速視頻原子力顯微鏡（HS-AFM）攻克了這一難關，向我們展示了GltPh的跨膜升降運動。
實驗開始前，研究人員將GltPh純化后與脂類組成的囊泡整合成跨膜結構，并用HS-AFM觀察。
在無基底的環境下，GltPh的三聚體結構清晰可見。當每個轉運結構域暴露在胞外的部分朝向顯微鏡的探針，即處于上升（up）狀態，突出的部分形成了一個三角形，中間則形成空洞（t=57s）；每個轉運結構域也可朝向胞內（t=58s），此時處于下降（down）狀態。
環境中單加入鈉鹽時，GltPh處于上升狀態的平均時間為33s，這意味著GltPh僅結合Na 離子時跨膜運動受到抑制。
加入充足的鈉鹽和谷氨酸，使環境濃度達到飽和后，GltPh處于上升狀態的平均時間為 11.1 s，開始進行活躍的跨膜轉運活動。
以上的結果證實了，當Na 和谷氨酸同時存在或缺失時，GltPh的跨膜運動相對于僅有Na 時更加活躍，GltPh是Na 和谷氨酸的協同轉運載體。
HS-AFM在進行高速成像的同時，保持了很高的空間分辨率，可以清晰地分辨三聚體的每一個結構域，使得我們可以對不同結構域運動之間的關系進行研究。
我們針對一個GltPh三聚體，通過視頻統計的數據計算了其處于不同狀態（結構域處于上升狀態的數量）的概率，結果與使用自由能公式計算出來的概率一致。
進一步對結構域運動的關系進行統計，可以得出三聚體的結構域之間運動是相互立的，這也直接驗證了之前的研究結果。
小結：使用HS-AFM獲得的高空間&時間分辨率的視頻圖像，可以準確地反應生物大分子的運動狀態，用于定量研究。
這項工作的完成主要借助了日本RIBM公司研發的超高速視頻原子力顯微鏡HS-AFM，HS-AFM突破了傳統原子力顯微鏡“掃描成像速慢”的限制，能夠實現在液體環境下超快速動態成像，分辨率為納米水平。待測樣品無需特殊固定，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動態觀測。推出至今，全球已有100多位用戶，發表SCI論文300余篇，其中包括Science, Nature, Cell 等頂級雜志。
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