類器官厚樣像共聚焦成像系統(tǒng)解決方案（一）
DAPI-細胞核，CK7-細胞質，F-ACTIN-細胞膜，TTF1-細胞核（強增值性細胞）
共聚焦顯微鏡物鏡的發(fā)展，特別是用于觀察厚樣本的物鏡，對匹配樣本和周圍介質的折射率至關重要，否則會影響成像深度。高數(shù)值孔徑的油浸物鏡雖然提供高分辨率，但當用于水樣本時由于折射率不匹配而面臨限制，導致球面像差。這影響了能夠有效成像的樣本深度，并降低了圖像質量。
圖1.折射率
為了解決這些挑戰(zhàn)，研究人員開始使用甘油作為一種折射率接近生物樣本的介質，將樣本置于甘油中，并使用甘油物鏡進行成像。隨著技術的進步，甘油物鏡的設計和性能不斷改進，成為現(xiàn)代顯微鏡中常見的物鏡類型之一。
表1. 常見封片劑類型及其介質折射率的表格
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封片劑類型 |
介質折射率 |
應用 |
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水基封片劑 |
約1.33 |
水溶性樣本，如染色后的細胞和組織切片 |
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硅油 |
約1.40-1.41 |
活細胞成像和深度成像 |
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VECTASHIELD®, ProLong®/ProLong® Gold |
約1.44-1.46 |
抗淬滅封片劑，長時間保持熒光穩(wěn)定性和減少光淬滅影響 |
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Fluoromount-GTM |
約1.45-1.47 |
常用的永久性封片劑 |
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Mowiol® 或PVA |
約1.41-1.49 |
用于熒光標記樣本，提供良好的折射率匹配和穩(wěn)定性 |
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BABB, FocusClear, DBE |
約1.45-1.56 |
用于透明化樣本的成像 |
如今，大多數(shù)固定樣本都使用基于甘油的Mowiol、Vectashield或類似混合物進行封片。這些介質的折射率接近80/20甘油/水混合物的折射率（ne=1.45）。甘油物鏡（介質折射率1.46）是在這種介質中封裝的樣本的更佳選擇。
由于折射率匹配，甘油物鏡減少了散射和光損失，在廣泛的波長范圍內都具有較好的透明度，提高了圖像質量和信號強度，因此可實現(xiàn)更深的成像深度（見圖3）。
圖2. 甘油物鏡與水鏡成像效果對比（深度：200微米），樣本來源伯楨生物bioGenous
配合校正環(huán)，我們還可以調整光學系統(tǒng)以適應封裝介質的折射率變化，或者由于蓋玻片厚度或溫度變化引起的折射率變化。
在本期中，我們深入了解了類器官成像領域，共聚焦顯微鏡物鏡的創(chuàng)新及其在觀測厚樣本中的重要應用。我們還探討了如何通過選擇與樣本折射率相匹配的浸沒介質來解決成像挑戰(zhàn)。甘油物鏡的應用充分證明了技術發(fā)展如何促進了成像質量和深度的提升，開辟了研究的新視野。
第二期我們將進一步探索類器官研究中的綜合成像解決方案，涵蓋自動化樣本定位、高倍率成像的自動轉換、三維結構的高分辨率成像，以及如何借助AI圖像分析軟件挖掘圖像中的深層信息。
我們邀請您繼續(xù)與我們同行，深入顯微成像技術的新領域，共同揭開細胞與生物分子研究的新奧秘。敬請期待我們的下一期內容，將為您帶來更多精彩洞見。
圖3. 肺腺癌類器官樣本，共聚焦成像，40x 甘油鏡，DAPI-細胞核，F-ACTIN-細胞膜，樣本來源伯楨生物bioGenous
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引用：
[1]https://www.nature.com/articles/s41578-021-00279-y
[2]https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35767871/
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