首創的小分子 MKK4 抑制劑助力癌癥新藥研究
你知道嗎？健康的肝臟具有幾乎無限的再生潛能！ 嚙齒類動物的經典實驗表明，當肝臟的一部分被手術切除時，肝臟可以在幾天內恢復到原來的大小……
人體肝臟約占體重的 2%，研究發現成人的肝臟具有顯著的再生能力，健康情況下，肝臟處于有絲分裂靜止狀態，但在毒性損傷或切除后，肝臟細胞可以迅速進入細胞周期以恢復肝臟質量和功能[1]。
肝臟再生是一個復雜的過程，涉及多種細胞類型的相互作用，包括肝細胞、肝星狀細胞、內皮細胞和炎癥細胞。通常情況下，肝細胞和 BECs 的增殖負責肝臟再生。盡管肝臟具有顯著的再生能力，但在急性損傷時，肝細胞和 BECs 逐漸喪失再生能力，并在各種慢性肝病中發生凋亡或衰老 (圖 1)。
圖 1. 肝臟再生機制[1]。
(A) 在肝臟穩態中，肝細胞和膽道上皮細胞 (BECs) 自我更新，而肝星狀細胞 (hsc) 大部分處于靜止狀態。常駐巨噬細胞清除受損細胞和消耗的紅細胞，并控制病原體從母體進入。(B) 在急性細胞損傷期間，肝細胞和膽道細胞增殖增加以重建受損組織，巨噬細胞吞噬細胞碎片并切換到促修復表型。(C) 在慢性肝細胞損傷中，大量肝細胞衰老，剩余的非衰老肝細胞增殖不足以恢復受損組織。作為導管反應的一部分，BECs 擴張，可以檢測到膽道源性肝細胞。巨噬細胞被激活，但在這種情況下，與急性損傷相比，不同表型的巨噬細胞之間的比例發生了變化，因此更多的促炎巨噬細胞積聚，引發明顯的免疫反應，激活hsc。活化的造血干細胞 (aHSCs) 有助于細胞外基質 (ECM) 的沉積和肝纖維化的發展。因此，慢性損傷以肝細胞衰老、炎癥和纖維化為特征。MMP: 基質金屬蛋白酶；TIMP：金屬蛋白酶組織抑制劑。
由于缺乏恢復肝細胞再生的療法，肝移植成為終末期肝病的唯一治療選擇。
MKK4 是一種 MAP2 激酶，是應激激活蛋白激酶 (SAPK)/絲裂原激活蛋白激酶 (MAPK) 信號網絡的一部分。當細胞暴露于不同的應激刺激時，MKK4 會被激活。MKK4 的下游底物是 JNK 1、2 和 3，它們也被 MKK7 激活，而 p38 MAPK 亞型則主要被 MKK3 和 MKK6 激活。
已有研究發現，短發夾 RNA (shRNA) mir 介導的 MKK4 沉默可通過破壞 SAPK 信號傳導 (主要通過 MKK7 和 JNK1 向 ATF2 和 ELK1 介導的下游促再生轉錄程序) 來釋放急性或慢性損傷肝臟中肝細胞的內源再生能力[3]。
圖 2. 體內 RNAi 篩選確定 MKK4 是肝臟再生的關鍵調節因子[3]。
在此次研究中，科學家通過 MKK4 shRNA 轉基因小鼠，證實了肝細胞中的 MKK4 基因抑制可增強肝再生，在經過長達 12 個月的全身性 MKK4 抑制的安全性評估后，發現通過抑制 MKK4 促進肝臟再生且不增加肝臟腫瘤發生風險。于是研究者進一步啟動了以 MKK4 為治療靶點的藥物發現過程，通過共結晶實驗成功分離出晶體，但由于檢測中的各種阻礙，無法建立可利用的 ATP 結合袋模型，研究者將目光轉向了已報道的蛋白激酶抑制劑 Vemurafenib，經過進一步的先導化合物優化產生了一系列 MKK4 抑制候選物。基于對 JNK1、BRAF 和 MKK7 的 >100 倍選擇性，HRX215 被選為臨床候選藥物。
圖 3. HRX215 發現及合成途徑[2]。
在藥物經過了細胞膜通透性及藥代動力學特性分析后，開始了進一步的小鼠體內藥理學分析，在 CCL4 誘導的肝損傷模型中，HRX215 增加部分肝切除后的肝細胞增殖并減弱細胞凋亡。同時，在酒精性脂肪性肝炎 (ASH) 模型和慢性 CCL4 治療誘導的肝纖維化模型中測試 MKK4i 時觀察到抗脂肪變性和抗纖維化功效。機制上，當給予 MKK4i 的小鼠接受部分肝切除術時，抑制 MKK4 后肝細胞中的促再生信號傳導依賴于增加的 MKK7 和 JNK1 信號傳導以及下游轉錄因子 ATF2 和 ELK1 的激活，先前的關鍵信號事件再次得到證實。
圖 4. MKK4 抑制劑 HRX215 可增強肝再生并預防肝衰竭[2]。
豬肝切除模型可以進行 80% 或 85% 肝切除，該模型忠實地反映了人類的肝臟再生，于是作者分別在 80% 和 85% 肝切除模型中研究 HRX215。在 80% 肝切除模型中，8 頭豬被隨機分配接受 HRX215 或對照治療。從手術前 24 小時開始，每 12 小時靜脈注射 HRX215 (5 mg/kg) 或對照載體。結果發現，HRX215 介導的 MKK4 抑制可增加豬肝切除模型中的肝細胞再生，并且，HRX215 介導的肝再生促進有效預防了豬 85% 肝切除術后的致命性 PHLF (post-hepatectomy-liver-failure, 肝后切除術)。在安全性上，HRX215 對心血管、神經或呼吸系統沒有任何影響，并且在嚙齒類動物和非嚙齒類動物中進行的 4 周毒性研究中 (大鼠為 300 mg/kg/天，狗為 250 mg/kg/天)，沒有藥物-觀察到相關毒性，未觀察到不良反應水平。
此外，臨床候選 HRX215 進行了首次人體 I 期試驗 (歐盟藥物監管機構臨床試驗 [EudraCT] 2021-000193-28)，結果顯示其具有出色的安全性和藥代動力學。這使 HRX215 用于預防/治療廣泛腫瘤肝切除后或小移植物移植后肝衰竭成為可能。
| Vemurafenib Vemurafenib (PLX4032) 是首創的，有效的 B-RAF 選擇性抑制劑，能夠抑制 RAFV600E 和 c-RAF-1 的活性，IC50 分別為 31 nM 和 48 nM。 |
| Carbon tetrachloride Carbon tetrachloride 通過交感神經通路誘導急性肝損傷。Carbon tetrachloride 引起肝纖維化和肝毒性。Carbon tetrachloride 具有口服活性。 |
| MKK4 蛋白, Mouse (sf9, His-GST) MKK4 蛋白是參與 MAP 激酶途徑的雙特異性激酶。它通過優先選擇 Thr 或 Tyr 殘基的磷酸化來激活應激激活蛋白激酶 (JNK)。 |
| ATF2 抗體 ATF2 Antibody 是一個非偶聯、分子量約 52 kDa、兔源、抗 ATF2 單克隆抗體。它可用于人、小鼠、大鼠背景下 WB 實驗，且不帶標記。 |
| alpha Tubulin 抗體 alpha Tubulin Antibody 是一個非偶聯、分子量約 50 kDa、兔源、抗 alpha Tubulin 單克隆抗體。它可用于人、小鼠、大鼠、倉鼠背景下 WB、IHC-F、IHC-P、ICC/IF、IP 實驗，且不帶標記。 |
參考文獻：
[1] Campana L, et al. Liver regeneration and inflammation: from fundamental science to clinical applications. Nat Rev Mol Cell Biol. 2021 Sep;22(9):608-624.
[2] Zwirner et al., First-in-class MKK4 inhibitors enhance liver regeneration and prevent liver failure, Cell (2024),https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.02.023
[3] Wuestefeld T, et al. A Direct in vivo RNAi screen identifies MKK4 as a key regulator of liver regeneration. Cell. 2013 Apr 11;153(2):389-401.
