一、胰蛋白酶(簡稱胰酶)

是廣泛應用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品，對蛋白質有水介作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細胞間質中的蛋白質水介而使細胞分散開，在常用的蛋白酶中由于產品的活力和純度不同，對細胞的消化能力也不同，胰蛋白酶對細胞的作用，取決于細胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無機鹽離子、pH以及消化時間的長短等。

細胞類型

胰蛋白酶適于消化細胞間質較少的軟組織，能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對含結締組織較豐富的組織，如 乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等就無效，但若與膠原酶合用，就能增加其對組織的分離作用。

酶的活力

市售的胰蛋白酶，其活力都經過測定而有效，但配制時必須新鮮，需保存在低溫冰箱中，消化時的pH和溫度都要適宜，否則會影響活力，細胞的分散直接與酶的活力有關，最終使用活力為1:200或1:250,56℃pH8.0時活力最強。

該酶為粉劑，保藏時要防潮，室內溫度不宜過高，保存時間不能太長，若粉劑結團塊，說明該部分受潮或失效。

酶的濃度

胰蛋白酶一般采用的濃度為0.1%-0.25%(活力1:200或1:250)，但遇到難消化的組織時，濃度可適當提高，消化時間適當延長。濃度高對細胞有毒性，而較低濃度的胰蛋白酶在培養液中可促進細胞的增殖，若培養液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。

溫度

一般認為胰蛋白酶在56℃時活性最強，但由于對細胞有損害而不能被采用，常使用的溫度為37℃，通常在37℃進行消化比室溫作用快。

pH

pH8~pH9是胰蛋白酶活力適宜范圍，但隨堿性的增加其活力也隨之減少，活性強分散快，細胞也容易被消化下來，消化分離細胞時PH只能選用7.6~8.0之間，否則對細胞有損傷。

無機鹽離子

若用含有鈣和鎂的鹽類溶液來配制胰蛋白酶時，可以發生抑制胰蛋白的消化作用。因此，在配制時應采用無鈣鎂離子的PBS配制。

消化時間

如果細胞消化時間過長，可以損害細胞的呼吸酶，從而影響細胞的代謝，一般消化時間為20分鐘為宜，冷消化時使用低濃度消化液，于4℃過夜也可。

二、膠原蛋白水解酶(簡稱膠原酶，Collagenase)

它能在生理PH和溫度條件下特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結構，而不損傷其它蛋白質和組織。膠原酶的化學本質是一種蛋白質，因此，這對溫度、PH和導致蛋白質變性的各種因素均非常敏感，極易受到外界條件的影響而改變其本身的構象和性質。
 

膠原酶按其存在的方式不同可分為人體內源性膠原酶和藥用膠原酶兩種。其中用于原代細胞分離的是藥用膠原酶（collagenase），它是從溶組織梭狀細胞芽孢桿菌提取制備的，主要水解結締組織中膠原蛋白成分。適于消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，可使上皮細胞與膠原成分分離而不受損害。常用劑量為最終濃度200U/ml（約為1mg/mL）或0.03%~0.3%
 

膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細胞專用膠原酶，要根據所要分離消化的組織類型選擇膠原酶類型。
 

1、膠原酶Ⅰ用于上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細胞的分離。用于消化組織中連接部分使其成為單個細 胞，用于哺乳動細胞的分離。　　

2、膠原酶Ⅳ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它能消化多種組織　　

3、膠原酶Ⅴ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它可用于胰腺小島組織的分離，將結締組織分離成單個細胞�！　�

4、膠原酶Ⅱ適用于肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織。

胰蛋白酶應用廣泛，特異性也差，一般用在間質少的細胞組織；中性蛋白酶作用相對特異性，常用于皮膚組織細胞的分離，比胰蛋白酶也要溫和點。以皮膚為例，胰蛋白酶既破壞橋粒也破壞半橋粒，其作用部位是基底層細胞和其上的棘層細胞，而中性蛋白酶只破壞半橋粒，不影響表皮細胞之間的連接，作用部位在基底膜Iv型膠原和纖維粘連蛋白。