前言
細胞與基因治療（CGT）在現代醫療尤其是癌癥和遺傳病的治療領域有著極大的發展空間，目前國內外已有多款包括溶瘤病毒藥物在內的CGT藥物獲批上市。

溶瘤病毒（OV）是一類新興的癌癥治療藥物，是目前研究較多的新型基因治療藥物。其中Ⅰ型單純皰疹病毒（HSV-1）重組病毒載體被廣泛用作OV載體^[1]，具有感染譜廣、病毒基因組容量大、對人體致病性較弱、可提高抗腫瘤療效等優點。

本文基于迪必爾生物CloudReady™（500 mL）云平臺生物反應器建立單純皰疹病毒載體HSV-1的制備工藝，驗證了高通量微小型生物反應器在單純皰疹病毒基因治療應用領域的優勢和適配性。

方法與結果
本工藝實驗在迪必爾生物“應用技術與工程研究中心（CARE）-病原微生物實驗室（BSL-2）”開展，所用病毒載體為中國科學院深圳先進技術研究院提供的Ⅰ型單純皰疹病毒重組病毒載體HSV-1-GFP。使用迪必爾生物 CloudReady™（500 mL）云平臺生物反應器（圖1）進行Vero細胞的培養。在初始200 mL工作體積下，Vero細胞接種密度為5×10⁵ cells/mL，微載體濃度為5 g/L。本次實驗工藝參數設置如表1所示。溫度由半導體Peltier模塊的加熱和制冷實現無水控溫。DO由空氣和氧氣的通氣速率級聯控制。pH由二氧化碳的通氣速率和堿液（0.5 M NaOH）的流加速率級聯控制。其中，進氣模式均為底部通氣。

表1 反應器工藝參數



圖1 CloudReady™生物反應器

為維持罐內營養物質水平并減少代謝物累積，Day2~3以1VVD的灌流速度進行灌流，Day0~3微載體上細胞密度變化如圖2所示。為保證病毒載體充分接觸并感染Vero細胞，在Day3細胞剛好鋪滿微載體而尚未達到最高細胞密度時，換液75%并以MOI=0.1接入HSV-1-GFP病毒載體。在Day5接毒48h后補充100 mL新鮮培養基，此后維持工作體積300 mL。Day6~7每天收獲50%上清液并補入等量新鮮培養基，Day8收獲全部上清液。
 

圖2 Day 0 ~ Day 3微載體上細胞密度變化曲線

在整個培養周期中，葡萄糖濃度維持在1g/L以上，葡萄糖和乳酸濃度變化如圖3所示。由每天取樣鏡檢圖像（圖4）可見，Day3時細胞剛好鋪滿微載體，此時接毒感染細胞，Day5開始觀察到CPE，部分細胞形態變圓，Day6~8呈現明顯CPE，最終大部分細胞裂解凋亡并脫落，上清液中可見細胞碎片。
 

圖3 葡萄糖和乳酸濃度變化曲線

圖4 每24 h取樣鏡檢圖

每天留取7 mL懸液混合后進行TCID₅₀測試，通過Reed-Muench法進行統計分析^[2]，計算TCID₅₀值為7.17×10⁶/mL。取200 μL懸液提取基因組，配置熒光定量體系（SYBR Green / ROX），通過qPCR方法檢測CT值為15.06。

結論

在病毒載體制備的工藝開發中，由于不同種類的病毒在感染宿主細胞時通常會表現出對特定細胞株的選擇性，并且關鍵工藝參數（CPP）如溫度、DO、pH、細胞密度、MOI、TOI、HOI等都需要進行測試和優化^[3]。迪必爾生物 CloudReady™云平臺生物反應器（圖5）應用靈活，可實現各類貼壁或懸浮細胞高密度培養，進行批次、補料、灌流等多種生物工藝的開發和優化，助力將QbD理念貫徹到病毒載體制備的工藝開發進程，在基因治療領域發揮應用潛力。
 

圖5 CloudReady™云平臺生物反應器

參考文獻

[1] Manservigi R, Argnani R, Marconi P. HSV recombinant vectors for gene therapy[J]. The Open Virology Journal, 2010, 18(4): 123-156

[2] Lei C, Yang J, Hu J, Sun X. On the Calculation of TCID50 for Quantitation of Virus Infectivity. Virol Sin. 2021, 36(1):141-144.

[3] Sascha Kiesslich, Amine A. Kamen. Vero cell upstream bioprocess development for the production of viral vectors and vaccines. Biotechnology Advances, 2020(44), 107608.

應用技術與工程研究中心(CARE) 張君軒 供稿