關節骨軟骨單元由關節軟骨、鈣化軟骨和軟骨下骨三部分組成，具有復雜的軟骨-骨界面，且不同組織層之間的特性不同。由于很難誘導間充質干細胞（MSC）向軟骨和骨進行定向的可控分化，因此骨軟骨單元的再生一直頗具挑戰性。

近年來，類器官（organoids）技術迅速發展，為骨軟骨再生提供了新的機會。然而，目前的主要局限是單一的支架和特定的培養基無法培養出具有異質性結構的類器官。采用其他方法嘗試加入誘導生長因子，以誘導間充質干細胞定向分化，但也面臨著實驗成本高、細胞易失活等問題。

對此，北京大學人民醫院和清華大學領導的研究團隊利用定制的微凝膠開發出一種自組裝的類器官，用于骨軟骨再生。這種類器官呈現出分層組織結構，且無需使用大塊支架或生長因子。這項成果已發表在《Bioactive Materials》雜志上，為推進組織工程領域的發展開辟了一條大有潛力的新途徑。
 

^{01 研究材料和方法}
研究材料和方法
研究人員設計并構建了透明質酸和羥基磷灰石修飾的明膠基微凝膠，之后將MSC（人臍帶間充質干細胞）接種到這些定制的微凝膠中，誘導其分化為軟骨細胞和骨細胞（成軟骨誘導培養基和成骨誘導培養基由賽業OriCell^®提供），之后通過自組裝形成骨軟骨類器官。然后通過掃描電鏡、qRT-PCR、mRNA-seq等方法對骨軟骨類器官進行了體外分析。最后將預分化的微凝膠注入比格犬的骨軟骨缺損處，在術后3個月和6個月對所有膝關節進行采集分析。

技術路線
1.制備CH-微凝膠和OS-微凝膠，將MSC接種到這些微凝膠中，誘導其分化為軟骨細胞和骨細胞。
2.將預分化的成軟骨和成骨微凝膠依次沉積為兩層，通過自我組裝形成骨軟骨類器官。
3.通過mRNA-seq分析確定微凝膠中的MSC定向分化為軟骨細胞和骨細胞的機制。
4.將預分化的微凝膠依次注射到比格犬的骨軟骨缺損處，評估骨軟骨類器官的體內修復能力。
 

02 研究結果 

定制微凝膠的制備思路
前期研究發現，可注射的微凝膠（microcryogels）提供了一種3D微環境，可用來加載基質、細胞和生物活性因子，為各種實驗模型的組織修復創造量身定制的細胞生態位。含有MSC的微凝膠可通過自我組裝形成3D功能組織，提高MSC的干性和旁分泌活性。為了進一步改善MSC微凝膠中細胞的成軟骨表型，研究人員故決定采用化學交聯策略。

為了給MSC的成軟骨分化和成骨分化提供合適的微環境，研究人員在基于明膠的前體溶液中分別加入透明質酸（HA）和羥基磷灰石（HYP），經過冷凍、鋪板、洗滌和凍干后形成CH-微凝膠（用于成軟骨分化）和OS-微凝膠（用于成骨分化）。之后將MSC接種到這些定制的CH-微凝膠和OS-微凝膠中，分別在成軟骨誘導培養基和成骨誘導培養基中培養7天，再將預分化的成軟骨和成骨微凝膠依次沉積為兩層，通過自我組裝形成骨軟骨類器官（圖1）。
 

定制微凝膠的制備示意圖^[1]

將定制微凝膠自組裝成骨軟骨類器官
在自組裝之前，研究人員首先評估了定制微凝膠中的成軟骨和成骨分化。染色結果顯示，與對照微凝膠相比，CH-微凝膠誘導成軟骨分化的能力更強，而OS-微凝膠具有很強的促成骨分化的能力。CH-微凝膠中的成軟骨標志物（COL2和SOX9）表達量較高，OS-微凝膠中的RUNX2基因表達量較高，但其他成骨分化基因（COL1、OCN和ALP）的表達量并無差異。

之后，研究人員將預分化的微凝膠移入邊長4mm的網狀框架內，并在骨軟骨誘導混合培養基（成軟骨分化：成骨分化=1:1）中培養7天。在預分化的微凝膠自組裝成骨軟骨類器官后，研究人員開展了體外分析（圖2）。掃描電鏡成像結果顯示，整個類器官呈多孔結構，軟骨成分和骨成分之間的界面整合良好。細胞追蹤顯示，自組裝的類器官包含兩層細胞，分別位于CH-微凝膠和OS-微凝膠中，這兩層細胞很好地整合在一起，沒有融合成一團細胞。有趣的是，兩種定制微凝膠促進血管生成的能力不同。CH-微凝膠中沒有新生血管，而OS-微凝膠中有許多血管生長，表明OS-微凝膠有更好的促進血管生成的潛力。
 

骨軟骨類器官的體外自組裝^[1]

定制微凝膠指導MSC的命運
接下來，研究人員對定制微凝膠開展了mRNA-seq分析，以揭示其指導MSC命運的機制。在成軟骨誘導7天后，研究人員比較了在對照微凝膠和CH-微凝膠中生長的MSC，總共發現了4408個差異表達基因（DEG）。為了更好地了解參與軟骨再生的DEG的基因功能，再將其分為軟骨細胞調節和免疫調控。結果顯示，與軟骨細胞增殖相關的基因顯著上調，而與免疫反應相關的基因則下調，包括對IL-1的反應、白細胞遷移、炎癥反應調節和T細胞介導的免疫等。KEGG富集分析顯示，3條通路上調（包括hedgehog、rap1和p53通路），8條與免疫調控和軟骨細胞肥大相關的通路下調，表明CH-微凝膠能夠促進成軟骨分化并抑制炎癥。

同樣地，在成骨誘導7天后，研究人員比較了在對照微凝膠和OS-微凝膠中生長的MSC。研究人員共分析了2158個下調DEG和3213個上調DEG。GO分析表明上調的基因與成骨細胞分化、骨化、骨發育、骨生長和骨礦化相關。KEGG分析顯示，與骨發育相關的通路（包括PI3K-Akt、FoxO、TGF-β、MAPK和Wnt通路）和免疫調控相關通路（mTOR、TNF和IL-17通路）顯著上調，而與細胞凋亡相關的p53信號通路則顯著下調。這些結果表明，OS-微凝膠能夠促進成骨分化并抑制免疫反應。

利用自組裝骨軟骨類器官來治療體內骨軟骨缺損
之后，研究人員利用比格犬股骨滑車缺損模型，測試了自組裝形成的骨軟骨類器官在治療體內骨軟骨缺損上的效果。他們將預分化的定制微凝膠依次注入比格犬的骨軟骨缺損處，在原位自組裝形成骨軟骨類器官，并在術后3個月和6個月對所有膝關節進行采集分析（圖3）。術后6個月，對照組的比格犬明顯跛行，但微凝膠治療組的比格犬在步態上明顯改善，僅有輕微跛行。核磁共振圖像顯示，術后3個月和6個月時都存在修復組織（如紅色箭頭所示）。

在術后3個月，觀察骨軟骨缺損處的修復組織，發現未治療對照組和對照微凝膠組幾乎沒有軟骨樣組織生長，對于骨軟骨類器官組，缺損修復的情況要好得多，但新生組織的外觀和平整度仍不如正常軟骨。術后6個月，對照微凝膠組的大部分缺損已被填充，但修復組織的外觀不平整。而在骨軟骨類器官組中，新生組織表現出閃亮且光滑的表面，與周圍的軟骨很好地整合，沒有明顯的邊界。組織學評估的結果也表明，骨軟骨類器官組的缺損再生效果優于其他兩組。
 

對原位自組裝類器官的骨軟骨再生進行體內分析^[1]

^{03 研究結論}

研究人員此次開發出一種新方法，通過設計定制的微凝膠來分別指導MSC命運，從而構建骨軟骨類器官。這些定制的微凝膠顯示出良好的細胞相容性以及誘導MSC分化成軟骨細胞和骨細胞的強大能力。在體內依次注射定制的微凝膠，可在原位自組裝形成骨軟骨類器官，實現軟骨和軟骨下骨的同時再生。這種策略有望實現界面組織的有效再生，而無需采用復雜或嚴苛的制造工藝。
 

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