熒光計算機斷層掃描技術(FLECT)成像原理及應用
瀏覽次數:2261 發布日期:2024-2-21
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導讀
小動物光學活體成像作為一種分子成像技術在生物醫學領域得到了越來越廣泛的應用,不同成像系統硬件和軟件上的不同設計導致了儀器間成像性能的差異。本文從技術原理和設備硬件結構的角度再就熒光成像技術做一個介紹,尤其是熒光計算機斷層掃描技術(FLECT)成像。
由于精諾真光學成像的專利保護早已經結束,近幾年市場的光學成像設備品牌在增加,尤其是國內品牌的增加。生物發光成像的技術門檻比較低,這種品牌的增多是有利于終端用戶的,在未來的2-3年,二維光學技術為主的設備市場價格會進一步降低,應該接近其合理的價位:80-120萬人民幣,考慮到質保年限,3-5年全保的價位應該在150萬以內,這里的全保是包括CCD的。
但是真正的三維小動物光學成像設備,還沒有拉開競爭的序幕。雖然原PE(Revvity)在市場上銷售了不少Spectrum,這僅僅是商業上的成功,而并非技術上的進步。三維光學活體成像的目標是高分辨率、真實定量、全深度、微量檢測、類PET的結果分析能力。
15年前科學家已經深入研究了影響光學小動物活體成像結果的因素[1],歸納為以下幾點:
1)不同成像設備的結果不一致;2)動物操作誤差;3)缺乏組織、疾病和免疫靶向的特異性染料;4)組織對比度;5)皮膚和組織的自發熒光;6)解剖學位置與熒光信號配準困難;7)缺乏成像儀器性能規范和標準;8)研究級別的光學小動物成像分辨率與臨床設備不平行;9)高背景光干擾;10)光子在生物組織中的自然散射;11)穿透深度。
圖1.小動物熒光活體成像結果影響因素[1]
本文以下內容如果沒有寫明光學、熒光/生物發光等,僅針對熒光成像技術。
一、熒光成像
1、技術原理
熒光(Fluorescence)是自然界的一種常見發光現象。當熒光物質受到激發光照射時,內部的分子或原子吸收光子從基態躍遷到激發態,隨后釋放能量發出波長更長的發射光,這種發射光就是熒光。將熒光物質共價結合或物理吸附在所要研究分子的某個基團上[2],具有無放射物污染、操作簡便、容易觀察等優點,可借助熒光特性對被標記對象進行定性、定位以及定量分析。
2、熒光發射計算機斷層掃描成像技術
熒光發射計算機斷層掃描(Fluorescence Emission Computed Tomography,FLECT)專利技術,榮獲科學雜志評選的“2011年十大創新技術”之一,是業界第一臺能夠提供定量熒光三維數據的設備,為臨床前小動物模型的全身成像和體內表征提供了無與倫比的檢測能力。如圖2所示,成像時激光直接導入FLECT準直器組件中,激發小鼠體內的熒光。一個由48個光電二極管組成的探測器環環繞在小鼠周圍,收集發出的熒光信號。通過激光光源和探測器圍繞待測動物旋轉,可設置不同層厚進行全角度斷層掃描,從而獲得3D數據。采集完成后,所獲取的FLECT數據被重建服務器重建成一個立體圖像,進行三維可視化觀察。
美國TriFoil Imaging開發了首臺斷層掃描技術融合的雙模態影像設備--InSyTe FLECT/CT。將FLECT和同軸一體的X射線CT斷層掃描成像整合到一個儀器中,提供具有解剖學參考的分子成像能力。采用其專利的旋轉龍門架設計收集完整角度的動物體內的光學和X射線投影,FLECT類同與PET和SPECT技術的光學成像,具有無放射性性,高性價比的優勢。探測器旋轉360°對熒光信號進行采集,結合600-900nm之間的近紅外激光光源,熒光斷層掃描技術重建算法使得熒光在實驗動物體內可實現無損耗三維重現,從而獲得動物深層組織的熒光信號,徹底解決了傳統設備熒光探測深度不夠、二維光斑不能精確定量等問題。
圖2.FLECT技術原理示意圖
二、重建高分辨圖像的能力
InSyTe FLECT/CT系統有兩個重建引擎,一個用于熒光圖像重建,另一個用于CT圖像重建。
1、熒光圖像
熒光圖像重建是將被測物體的表面信息與采集到的熒光數據結合起來,形成熒光源在被測物體中分布的三維表征。將表面信息和熒光數據提交至專用的重建服務器。采用熒光重建專用引擎(FluoroTom),利用輻射傳遞方程和球諧函數,基于組織中光傳播的正演模型以“有限差分”方法導入傳遞方程。考慮了組織的光散射、吸收和反射等光學特性,以及組織結構的影響,模擬光在組織中的傳播路徑、分布和吸收情況,是目前最精確的光學定量技術。
FLECT能夠提供多角度重建方法和360°三維熒光成像功能,獲取全角度成像三維影像,可從冠狀,矢狀,橫斷觀察感興趣區域(Region of Interest,ROI),定位光斑位置,生成沿著z軸旋轉的動態最大密度投影動畫(Maximum Intensity Projection,MIP),并能保存所有深度精準的熒光信號點的三維信息及總含量信息。如圖3所示,FLECT可對熒光信號的反射、散射吸收和校正,在不同的熒光濃度中具有一致的線性(R²=0.9985),確保了準確性和重復性。
FLECT可以精確地追蹤熒光信號,將解剖學位置與熒光信號共配準融合,極大地提高了定位的準確性和數據的可靠性。雖然我們的常規成像設備在小動物成像上表現出色,但在深層的組織成像中,我們仍面臨分辨率不足的問題。如圖4所示,FLECT的分辨率能夠達到1mm3,展現出臨床水平的成像效果。覆蓋大多數組織的深度,可以達到2.4-4cm的檢測能力,利用先進算法對熒光信號的反射、散射吸收和校正,直接輸出無背景光的圖片,更清晰地觀察到深層的熒光信號,體現了技術的可靠性和算法的先進性。

圖3.重建濃度與注射濃度擬合曲線
圖4.高分辨率熒光圖像重建
2、CT圖像
利用X線穿透不同密度和厚度組織結構后,發生不同程度吸收而產生的影像對比,形成不同灰階圖像。高密度組織(如:骨骼),具有較高的衰減系數,CT上顯示亮;低密度組織(如:肺),具有較低的衰減系數,CT上顯示暗。
采用COBRA錐形線束算法,真正在軸位旋轉掃描時實現三維圖像的采集和重建。使用CT濾光片(鋁、鉬和錫)來增強軟組織對比度并減少束流硬化效應,通過去除、降低錐形線束引起的偽影來獲得最佳的CT圖像質量。可以對整個ROI或部分ROI區域的X射線投影進行重建。投影次數越多,重建時間越長,得到的圖像分辨率越高。

圖5.FLECT/CT骨骼成像效果(可見骨小梁結構)

圖6.FLECT/CT軟組織成像效果(可評估肺結節纖維化程度)
3、共配準融合
InSyTe FLECT/CT采用雙滑環技術,微型X射線管(激光光源)與高靈敏度探測器一同圍繞攝影對象(小鼠)連續做斷面掃描。具備多模態同軸化掃描,可多模態圖像精準融合。
CT成像單元和FLECT成像單元采用同軸化雙模態設計,一次性掃描成像,無需重新擺放或移動樣本。避免了多模態圖像融合的潛在問題:如:融合位置不精確、延遲等。CT系統不僅能提供解剖學相關信息,還能改善散射校正,提高光學成像精度。

圖7.FLECT/CT用于肺靜脈栓塞診斷成像[3]
(應用實例[3]:研究團隊開發了一種特異性熒光探針(Targ-Cy7),單鏈抗體scFv靶向結合血栓中活化血小板受體GPIIb/IIIa,用于頸動脈血栓、肺靜脈栓塞體內成像。)
三、深層組織檢測能力
1、生物組織對光線的吸收
在700-900nm這段近紅外區域內,存在一個“光譜窗”(Spectral Window)。在這個“光譜窗”內,生物組織對光線的吸收作用大大降低,光線可以進入更深一些的組織。同時,由于血紅蛋白和細胞色素含氧量不同導致的吸收光譜的差異仍然可以分辨。當波長大于900nm時,組織中的水成分對光子的吸收作用十分強烈,光子進入組織數毫米就會被吸收殆盡。而在低于700nm的可見光范圍內,血紅蛋白對光線的吸收作用大大增加,同時,組織的散射作用也十分厲害[4]。因此,在醫學研究中通常使用波長位于光譜窗內的近紅外光作為探測光源。
FLECT采用被稱作“醫學光譜之窗”的介于600-900nm之間的近紅外光,如圖8所示,利用該波段光譜低自發熒光、低組織吸收以及良好的組織穿透能力等優點。該波段熒光染料具備全身、深部組織斷層成像所需的最佳特性。

圖8.近紅外1區組織吸收系數
2、激發熒光的光源
激光光源是利用激發態粒子在受激輻射作用下發光的點光源,是一種相干光源。特點是方向性好、發散角小(約0.18度),比普通光源小2~3個數量級,傳播方向/振動方向/頻率/相位一致。激光二極管產生的光束具有高亮度和單色性,可以集中光能并減少散射,使得激光光束能夠穿透組織較深的部位,提高信號強度和圖像質量。產生的單波長光束具有較窄的譜寬,有助于減少組織中其他非目標熒光信號的干擾,提高測量的準確性和可靠性。
FLECT采用激光作為激發光,對熒光源的激發效率較高,遠遠優于寬帶光源,安裝在超低反射率、0.1Na準直器中進行聚焦,覆蓋動物周圍360度,使得激光光束能夠穿透組織較深的部位,在接收器上生成清晰而集中的圖像。如圖9所示它的熒光檢測器是由48個高靈敏度、低噪聲的硅光電二極管組成的探測器環(量子效率>85% @ 500-900 nm),掃描時每一層的每一個角度都被采集48次,通過算法的優化和校正,得到的數據更準確。
FLECT標配4組激光光源:642nm(80mw)、705nm(40mw)、730nm(40mw)、780(100mw);五種發射濾光片:695/20、710/45、803/60、813/40、853/45,每個檢測器上都裝有5個濾光片,一共是240片。可兼容目前市面上所有主流熒光染料,包括近紅外熒光探針、熒光染料和熒光蛋白,如Cy5、Cy5.5、ICG、Cy7、Alexa Fluor 647 、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 750 、IRFP、RFP、量子點、納米材料等。



圖10.FLECT/CT用于骨靶向探針體內成像[5]
應用實例[5]:研究團隊開發了一種骨靶向特異性熒光探針(P800S03-PEG),優先積累在骨代謝活躍區域,如脊椎、骨關節。
四、活體內三維定位能力
在光學活體成像中,理想情況下,信號與靶標的實際位置能夠100%的重合。然而,倘若檢測到的信號發生偏移,導致錯誤定位,那么這種情況相較于沒有信號,實則更加糟糕!我們注意到,二維成像的熒光強度受拍照角度的限制和檢測深度的限制,如果對小鼠的正面、背面、側面不同方向的熒光成像,它的熒光強度和位置是不一致的。此外,受背景光的干擾,不得不解剖小鼠,離體成像得到結果,不僅增加了實驗的復雜性和難度,也限制了一些實驗方案的設計,其原因主要包括光學特性和成像設備的檢測方法等。
從光學特性角度來看,當光子從組織表面某處進入組織,并以一個固定的速度傳輸。這個速度取決于該介質的光折射率(即光速(mm/sec)=3.0×1011/n,n是該介質中的折射率)。光子在傳輸過程中會發生兩種情況:一種情況是光子在某個傳播位置上被組織內的載色體吸收而停止繼續傳播;另一種情況是光子遇到一個可以被看成散射源的粒子,這時就會發生隨機性的彈性碰撞(即只改變其傳輸方向而速度保持不變)。光子由于彈性碰撞改變了飛行方向,并沿著這個方向繼續傳播,而后此光子或被吸收或再次發生散射。這個過程不斷進行,直到光子被吸收或逸出介質[4]。
從光學成像設備的檢測方法來看,現有的光學成像系統借助單個檢測器通過反射(a)或透射(b)方式,實現探針在樣本體內成像。在反射成像時,激發光(輸入)照射樣本表面,然后收集來自樣本同一表面發出的熒光(輸出)。透射光是從檢測器的相反方向照射樣本,因此光傳播路徑是穿透樣本的。這兩種方法都存在明顯弊端:反射法僅能從動物體表面收集到準確的數據;而透射法由于使用單個檢測器,使得整個樣本的成像質量并不統一,輸出側的靈敏度和分辨率都要高于輸入側[6]。
FLECT技術是從樣本的全方位角度進行激發并精確測量發射光子,避免了局部斷層成像方案中出現的扭曲失真和偽影情況。因為激發光和熒光發射光是要透過動物樣本這個散射介質,光的散射會影響分辨率和定量結果。FLECT先進的重建算法已將這些因素考慮在內,通過在動物樣本實際體積內建立3D分布模型并使用精確的光在組織中傳播模型來解決這些問題。這種方法與以前的方法相比少了很多的假定,從而提高了成像性能。

圖10光學成像系統檢測方法[5]
圖11.FLECT/CT用于腫瘤靶向探針多模態成像[7]
應用實例[7]:研究團隊利用熒光染料Cy7和放射性Cu64,雙標記轉鐵蛋白包裹的納米探針(64Cu-GdF3@Tf-Cy7 NPs)上,能夠進行PET和光學成像。探針會靶向結合到腫瘤上,如果腫瘤發生淋巴轉移,會先被前哨淋巴結中的巨噬細胞吞噬,前哨淋巴結出現熒光。作用利用CT、PET/CT、FLECT/CT三種成像結果,可視化原發腫瘤是經前哨淋巴結轉移的。
五、熒光絕對定量能力
隨著市場上各種熒光標記試劑盒的出現、分子探針以及報告基因轉染的進展,熒光成像變得更加容易,并且可以在大多數實驗室進行。傳統上,二維光學成像在高通量篩選中有著典型的應用,而三維光學成像則被用于定量研究。二維光學成像在探測生物發光和表面熒光信號、篩選“是/否”定性方面非常有效;然而,由于生物組織對可見光和近紅外(NIR)波段光的非線性衰減,隨著熒光源深度的增加,數據變得更加不確定性和不可靠。二維光學成像由于缺乏深度信息而產生數據采集缺失,同時缺乏解釋光子的算法理論問題。例如,腎部成像時,動物應處于俯臥位,肝/膀胱顯像時,動物應處于仰臥位。研究人員必須手動改變動物的位置,從不同角度觀察它,這就是二維熒光成像的所謂“位置敏感”問題。
FLECT同時獲取透射信號和反射的全角度信號。利用CT采集的數據進行基于對比度的分割,將光學數據應用于CT選擇的指定區域,并執行重建。在動物周圍360°采集信號,因此,FLECT克服了“位置敏感”問題。FLECT是目前最精確的光學定量技術,此突破性的光學成像性能助力研究人員產出真正前所未有的實驗成果,實現熒光信號的絕對量化。
1、不同深度的定量結果
利用光學特性的圓柱形模擬假體(µa = 0.1 cm-1, µs’=10 cm-1),距表面12 mm和5 mm的深度含有2個直徑為3 mm的內腔,用于模擬淺表層和深層的檢測深度。通過將倍比稀釋后的,不同濃度的熒光染料填充到假體進行掃描,建立濃度-熒光強度的標準曲線(1-13 μM)。
FLECT/CT的定量結果:R2(@5 mm)=0.9814;R2(@12 mm)=0.9921

圖12.不同深度的定量結果
圖13.測試用假體與小鼠體內熒光強度擬合曲線
2、不同方向的定量結果
將不同濃度的ICG熒光染料(1.25μM、2.5μM、5μM、10μM)填充到假體進行掃描,建立濃度-熒光強度的標準曲線。注射已知濃度(2.5μM)ICG,調整假體方向,進行成像并計算濃度。
如圖14所示,FLECT/CT的定量結果:R2(@12 mm)=0.9964,檢測濃度是2.2μM;不僅準確定位到假體中的熒光信號,而且不同角度的成像結果是一致的;說明FLECT采用360°檢測熒光信號,成像結果不受檢測方向的影響,克服了位置敏感性的問題。

圖14.不同方向的定量結果和濃度-熒光強度標準曲線

圖15. FLECT/CT用于腫瘤相關免疫細胞靶向探針態成像[8]
應用實例[8]:研究團隊開發了腫瘤相關免疫細胞靶向探針SH1,不僅獲得了SH1、ICG和IR-780熒光探針的體內生物分布圖像,還對腫瘤區域的熒光探針積累濃度進行了定量。定量結果有力的證明了SH1的優異性,用于腫瘤的診斷。
結論
綜上所述,熒光發射計算機斷層掃描技術(FLECT)克服了已有熒光成像的局限,解決熒光在動物體內的精準三維定位、檢測深度、高分辨率圖像、定量實驗,實現功能成像與結構成像兩種方法學的結合,為科研工作者提供了更為準確、高效的臨床前研究工具。
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