高通量篩選技術應用于神經退行性疾病相關藥物篩選的實例
由于全球的老齡化趨勢加劇，神經退行性疾病 (NDDs) 的患病風險逐漸升高，對 NDDs 病理靶標的發現及確認更是挑戰滿滿。高通量篩選技術在神經退行性疾病中的大量應用無疑加快了相關藥物的開發速度。今天我們就一起來了解一下吧~
神經退行性疾病 (Neurodegenerative diseases, NDDs) 是由中樞神經系統或周圍神經系統神經元功能喪失，導致其功能障礙的一類神經系統疾病，通過影響記憶、認知、行為、感覺和運動功能，嚴重影響數百萬患者的日常生活。
Tips：高通量篩選利用自動化系統能夠同時測試數千至數百萬個樣品，可在模型生物、細胞、或分子水平上驗證生物活性，篩選已知結構的小分子化合物、化學混合物、天然產物、寡核苷酸和抗體等等。
本期由小 M 帶著大家一起從 NDDs 的病理標志出發，學習一下高通量篩選在神經退行性疾病研究中的一些實例吧！
據 Wilson DM 3rd 在 Cell 上發表的綜述“Hallmarks of neurodegenerative diseases ”報道，NDDs 的標志主要分為八大類：病理性蛋白的聚集、突觸和神經元網絡功能障礙、蛋白質穩態失衡、神經元細胞骨架異常、能量穩態失衡、脫氧核糖核酸和核糖核酸缺陷、炎癥、神經元細胞死亡[1]。而這些標志也是開發 NDDs 相關藥物的重要著手點。本期小 M 為大家主要介紹 NDDs 的其中三大病理標志。
圖 1. 神經退行性疾病的分子學標志[1]。
首先咱們來說說作為 NDDs 關鍵病理標志之一的病理性蛋白的聚集。病理性蛋白的過度聚集具有神經毒性，會影響神經系統的正常功能。例如，在帕金森疾病中，大腦內 alpha-synuclein (α-syn) 異常沉積形成路易小體；阿爾茲海默癥中，β-淀粉樣蛋白 (Aβ) 沉積導致的淀粉樣斑塊，Tau 微管結合蛋白磷酸化后形成神經元纖維纏結等。
接下來，我們就以 Tau 蛋白抑制劑的高通量篩選試驗為例更直觀地感受一下吧~▐ 應用：Tau 蛋白抑制劑的篩選
相較于傳統的藥物篩選，Dehdashti SJ 等人運用均相時間分辨熒光技術 (Homogeneous Time-Resolved Fluorescence, HTRF) 和 AlphaLISA 實驗進行了快速、高效的高通量篩選，最終從 1280 個化合物中篩選出了 4 個能夠抑制 SH-SY5Y 細胞中 Tau 蛋白水平的先導化合物，加快了 NDDs 中 Tau 蛋白抑制劑的篩選速度[2]。
圖 2. AlphaLISA 和 HTRF 法檢測 Tau 蛋白含量[2]。
(A) tau 蛋白測定的分步程序。將 SH-SY5Y 細胞接種在測定板中并孵育 4 小時，然后添加化合物。與化合物一起孵育 3 天后，裂解細胞并添加檢測試劑 (AlphaLISA 或 HTRF)。孵育 2 小時后，使用讀板器捕獲信號。(B) AlphaLISA tau 測定原理圖示。(C) HTRF 測定原理圖示。
多種神經退行性疾病中有毒蛋白聚集體的積累與自噬-溶酶體途徑（Autophagy-Lysosome Pathway, ALP，真核細胞中維持蛋白質穩態的途徑之一）的缺陷有關，通過調節溶酶體功能的主調節因子 TFEB 可以改善多種神經退行性疾病模型的疾病表型。
▐ 應用：TFEB /TFE3 的激酶調節因子篩選今年 2 月，Carling PJ 等人使用高通量篩選從激酶抑制劑庫中發現了具有神經保護作用的 TFEB 和 TFE3 的激酶調節因子。經過進一步的機制研究，作者發現喹唑啉結構類似物通過上調 CLEAR 基因的轉錄，清除 Huntingtin (HTT) 聚集體，從而調節溶酶體功能發揮抗神經損傷作用[3]。
圖 3. 高通量篩選 TFEB 和 TFE3 的激酶調節因子[3]。
(A) 在所有測定中以 1 µM 篩選 490 種 PKIS2 化合物，并通過級聯分析來鑒定無毒化合物。(B) AK 釋放和 (C) 免疫細胞化學圖像的核計數用于評估細胞毒性。(D) 活性溶酶體計數和 (E) 通過 DQ Red BSA 測定測量的校正熒光強度用于評估溶酶體毒性。對于 (F) 核 TFEB (% nTFEB) 和/或 (G) 核 TFE3 (% nTFE3) 易位。總共確定了 74 個陽性命中。
初篩時，作者使用 AK 含量測定發光試劑盒檢測了化合物 (1 μM) 對人誘導多能干細胞 (hiPSC) 中腺苷酸激酶 (Adenylate kinase, AK) 含量變化 (圖 3 B,C)，通過 DQ™ Red BSA 試劑檢測溶酶體活性情況 (圖 3 D,E)。根據 AK 含量和溶酶體活性結果，作者剔除了能夠誘導細胞毒性或線粒體毒性的化合物。
復篩時，作者使用免疫細胞化學法 (ICC) 測定了不同化合物 (0.01-2 μM) 對 TFEB 和 TFE3 入核情況的影響 (圖 3 F,G)，篩選出了 74 種能夠顯著促進 TFEB 或 TFE3 入核的化合物[3]。
神經元是一類對能量要求比較高的活躍細胞，能量代謝的紊亂會極大程度的影響神經元的正常功能，導致 NDDs 疾病的發生。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 是能量代謝過程中的一種重要輔酶，在維持神經元健康中發揮重要作用。
▐ 靶向 NAMPT 的小分子激活劑篩選
Hong Yao 等人根據 NAD 代謝調控神經退行性疾病這一科學熱點，通過高通量篩選和基于靶點結構的藥物設計，篩選出了靶向NAMPT (Nicotinamide Phosphoribosyl Transferase, 煙酰胺磷酸核糖基轉移酶，是 NAD 合成的一大關鍵限速酶) 的小分子激活劑 (NAT)，實驗結果證明 NAT 能夠通過促進 NAD 的生物合成，發揮神經保護作用[4]。
圖 4. 高通量篩選鑒定一種新的NAMPT 激活劑[4]。
(A) 高通量篩選 NAMPT 激動劑的程序示意圖。(B) 三偶聯的 NAMPT 酶反應在室溫下用 DMSO 或 10 μM 的 NAT 進行 20 分鐘，開始時加入或不加入 NAM。(C) 在指定濃度的 NAT 或 NAT-5r 存在下進行 NMNAT1 酶測定。
首先，作者通過高通量篩選體外重組酶實驗篩選出了數個能激活 NAMPT 的小分子。從中，作者選擇了能強烈刺激 NAMPT 活性，但在 NMNAT (Nicotinamide Nucleotide Adenylyltransferas, 煙酰胺核苷酸腺苷酸轉移酶) 測定實驗中沒有活性的小分子化合物 NAT。
接著，為改善 NAT 的藥理學性質，作者對 NAT 進行了結構修飾和優化，共合成 81 種 NAT 衍生物。最后，作者在細胞水平及動物水平中驗證 NAT 化合物的作用機制，發現 NAT-5r 通過有效提高細胞內 NAD 水平，并誘導隨后的代謝和轉錄重編程過程，從而發揮神經保護作用。
這次小 M 從 NDDs 的病理特征出發，列舉了三個高通量篩選技術應用于神經退行性疾病相關藥物篩選的實例，生動的講述了高通量篩選技術從理論到實際操作的一個運用，各位小伙伴們學會了嘛~
| 神經退行性疾病化合物庫 1,900+ 具有抗神經退行性活性的化合物或靶向神經退行性疾病主要靶點 (Amyloid-β，Dopamine Receptor，COMT 等)的化合物。 |
| 抗帕金森病化合物庫 1,100+ 具有抗帕金森病活性的化合物及靶向帕金森病主要靶點 (Dopamine Receptor，LRRK2，5-HT Receptor 等) 的化合物。 |
| 神經信號化合物庫 2,300+ 神經信號相關的小分子化合物，主要靶向 G 蛋白偶聯受體 (GPCRs) 和 Notch 信號，是研究神經調控及神經疾病的有用工具。 |
| 神經保護化合物庫 900+ 具有潛在神經保護作用的化合物，主要靶向神經保護通路中的主要靶點，如鈣離子通道，鈉離子通道，腺苷 A1 受體等。 |
| 神經遞質受體化合物庫 1,600+ 神經遞質受體相關的化合物，是神經系統疾病藥物篩選的有效工具。 |
| 可透過中樞神經系統化合物庫 800+ 被明確報道可以透過血腦屏障的小分子化合物，是開發腦部疾病藥物如腦瘤、精神障礙和神經退行性疾病等有效的工具。 5-羥色胺受體化合物庫 200+ 5-羥色胺 (5-HT) 受體抑制劑及激動劑，可用于多種精神類藥物的開發。 |
參考文獻：
[1] Wilson DM 3rd, et al. Hallmarks of neurodegenerative diseases. Cell. 2023 Feb 16;186(4):693-714.
[2] Dehdashti SJ, et al. A high-throughput screening assay for determining cellular levels of total tau protein. Curr Alzheimer Res. 2013 Sep;10(7):679-87.
[3] Carling PJ, et al. Multiparameter phenotypic screening for endogenous TFEB and TFE3 translocation identifies novel chemical series modulating lysosome function. Autophagy. 2023 Feb;19(2):692-705.
[4]Yao H, et al. Discovery of small-molecule activators of nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) and their preclinical neuroprotective activity. Cell Res. 2022 Jun;32(6):570-584.
標簽：
高通量篩選 藥物開發 神經疾病
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