浸沒式物鏡：使用油、甘油或水來克服分辨率限制
浸沒液體
光學顯微鏡所面臨的主要問題之一是克服某些光學分辨率的限制并提高系統的NA值。簡言之，物鏡的NA是指從標本中收集光的能力，而分辨率是指物鏡分辨標本中細節的能力。
分辨率和NA將在其他文章中詳細說明，我們現在將介紹顯微鏡專家可用的浸沒技術，這種技術可在高倍放大率下對標本進行成像，同時克服分辨率的一些限制。
在物鏡前透鏡和標本蓋玻片之間的空隙中填充浸沒液體可提高物鏡的分辨率。當光從一種介質傳遞到另一種介質（例如，通過玻璃到空氣）時會發生折射 - 換句話說，光會彎曲并散射。任何折射到空氣中的光線、被蓋玻片反射的光線或被物鏡前透鏡的金屬外殼實際阻擋的光線都不會對成像產生貢獻。浸沒液體的目的在于減少光在標本上形成的折射和反射，并提升物鏡捕捉這些偏離光的能力（見圖1）。
圖1
折射率
光線穿過的介質的物理性質決定了光線被折射的程度。“折射率”是一個數值（沒有單位），該數值決定了光通過材料時的折射程度。空氣的折射率為1.0，而顯微鏡載玻片和蓋玻片的折射率通常為1.5。考慮到這一差異，浸泡液體的目的是匹配（盡可能接近）玻片的折射率，從而增加形成最終圖像的光線量。隨后，大多數浸油的折射率為1.51。常見折射率見表1。
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浸沒介質 |
RI |
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空氣 |
1.00 |
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水 |
1.33 |
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甘油（100%） |
1.47 |
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香柏油 |
1.51 |
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徠卡浸沒油（標準和“F”型） |
1.51 |
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玻片 |
RI |
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玻片（硼硅酸鹽或“Parex”） |
1.47 |
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玻片（冕玻璃或鈉鈣硅玻璃） |
1.51 |
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封片介質 |
RI |
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細胞培養基 |
1.31至1.33 |
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Fluoromount-G™ |
1.4 |
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ProLong®/ProLong® Gold |
1.46 |
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VECTASHIELD® |
1.44 |
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VECTASHIELD® Hard+Set™ |
1.46 |
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Mowiol® |
1.41 – 1.49 |
均質浸沒系統
理想情形是創建所謂的“均質浸沒系統”。使用該系統可以獲得最大的分辨率和NA。均質浸沒系統的目的是匹配（盡可能接近）物鏡前透鏡、浸沒介質、蓋玻片/載玻片、封片劑和（原則上）聚光鏡透鏡的折射率和NA（見圖2和表1）。
通常不需要在聚光鏡的透鏡上使用浸沒液體。如果顯微鏡的設置和校準正確，且在整個樣本上獲得最佳對比度和照明度（見“關于科勒照明”的文章），則聚光鏡將處于最適宜的位置和設置，從而有助于顯微鏡系統的整體NA。
圖2：標本和物鏡前透鏡之間所有光學元件的折射率會給圖像質量帶來很大影響。理想情況下，它們應盡可能緊密地相互匹配，如本例中的標本使用甘油基封片劑。
工作距離
顯微鏡物鏡需要考慮的另一個因素是“工作距離”。這是當樣本處于銳聚焦時，物鏡前透鏡和蓋玻片表面之間的實際距離（見圖3）。當物鏡移到離載玻片更近的位置時，焦平面進一步移向樣本中。然而，這在物理上受到限制，因為物鏡只有在接觸到蓋玻片后才能移動。工作距離與每個物鏡的放大倍數成反比關系。例如，10倍物鏡的工作距離可能為4 mm，而100倍油浸物鏡的工作距離通常為0.13 mm。相比之下，一些水浸/水澆蘸（Water Dipping）物鏡的工作距離約為3 mm。工作距離是另一條信息，通�？淘谖镧R筒上，縮寫為“WD”（不要與水鏡混淆-見下文）。
圖3
浸沒油和油浸式物鏡
使用油浸物鏡時要記住的一個關鍵因素是使用正確匹配的浸油。只能使用物鏡制造商推薦的油。多年來，杉木油是常用于浸沒介質（目前仍在市場上出售）。雖然這種油的折射率為1.516，但存在硬化趨勢，如果使用后不取出，可能會損壞透鏡。此外，這種油會吸收藍色波長和紫外線，而且老化時會不斷變黃。
圖4
大多數現代化浸油都是人工合成并經過標準化處理，確保不會損壞透鏡或隨著老化而變色。要記住的一點是，浸油有一個最佳的工作溫度。大多數商用合成油的設計工作溫度為23℃，僅1℃的變化將導致折射率變化0.0004。其他浸油可在不同溫度下獲得最佳性能，但對于大多數用途，顯微鏡設備應在23℃下保持穩定（這對于共聚焦顯微鏡等儀器的維護也很重要）。
使用油浸式物鏡（見圖4）開展熒光顯微鏡觀察時，建議使用特殊的低自體熒光油。很多通用浸油在特定情況下將會發出熒光。大多數用于熒光顯微鏡的浸油都通過名稱/代碼之前或之后加上字母“F”來識別。
油浸式物鏡的使用
從使用低倍物鏡查看樣本開始，在切片上找到感興趣的區域。
逐步切換至40倍放大率并將顯微鏡設置科勒照明。
通過物鏡轉盤（物鏡的連接底座）在40x和100x物鏡之間切換但不要直接接觸高倍物鏡。
從顯微鏡的一側看去，小心地將1滴浸油直接滴到蓋玻片上。將高倍物鏡擺入到位（繼續從一側觀察載物臺），先粗調然后微調對焦，讓物鏡前透鏡與浸油發生接觸。有些油浸物鏡的前透鏡是凹面的，這意味著還應該在物鏡上滴一滴油以防止氣泡被困在凹透鏡中。
然后可以再次通過目鏡觀察。僅使用微調對焦來調整視野。雖然高倍物鏡含有彈簧加載式轉換器，但在這個階段粗聚焦很容易導致蓋玻片或載玻片破裂，也可能損壞物鏡前透鏡。
即便您計劃觀察其他載玻片，也應在此階段清除物鏡上的浸油以防止可能污染顯微鏡的其他部分。對于不適合浸沒的顯微鏡部件和物鏡，浸油會滲透并造成損壞。用鏡片清潔紙巾在鏡片上擦一次，去除多余的油。每次擦拭都要用干凈的紙巾擦拭物鏡前透鏡，直到沒有殘留油的痕跡。可使用市售除油溶液或少量二甲苯最終清潔透鏡。同樣，在對透鏡應用任何溶液之前，請務必仔細了解物鏡制造商的建議。
水浸式物鏡
在研究級顯微鏡（通常是共聚焦顯微鏡）上有一種不太常見的浸沒式物鏡是“水浸”物鏡，通常在物鏡筒上縮寫為“WI”或“W”。當對細胞培養基中的活細胞成像時，強烈建議使用水浸式物鏡。有兩種類型的水浸式物鏡（見圖5）-“水浸”和“水澆蘸”（物鏡筒上通�？s寫為“WD”，不要與“工作距離”混淆）。
圖5
水浸式物鏡通常與正置顯微鏡配置一起使用，用于直接浸入水或水基介質/緩沖液中。水澆蘸物鏡則可提供很長的工作距離。這種物鏡在生產時還配有十分曲折的彎角轉盤，使用惰性材料如陶瓷等制作而成。水浸物鏡的使用方式與油浸物鏡類似，但要用水代替油。
使用水浸式物鏡的優點之一是簡單地將水作為浸沒介質。很明顯，這種介質很容易清洗。此外，您不需要根據正在進行的成像使用特定的浸沒油，也不需要使用顯微鏡和物鏡制造商指定的浸沒介質。但使用水浸式物鏡時有一些缺點。與水性物鏡相比，油浸物鏡具有更高的分辨率。此外，由于水的粘度（與油相比），使用水浸式物鏡容易受到振動和小空氣運動的影響。這種問題可以通過確保顯微鏡放置在防振臺上來克服。或者，更簡單的解決方案是在切片上放置一個特殊的環來形成一個小水池。水浸式物鏡的最后一個缺點是成本。一些水浸式物鏡的成本相當于一套完整的研究級顯微鏡。
徠卡提供的水浸顯微鏡自動加水裝置克服了長時間活細胞成像或篩查實驗中出現水蒸發的潛在問題（見圖6）。
圖6：水浸顯微鏡自動加水裝置在實驗運行中自動添加浸沒用水。
活細胞成像
活細胞通常置于細胞間室并且會被細胞培養基（或緩沖液）所覆蓋。間室（和培養基）有助于確保細胞或組織在成像的同時處于穩定的環境內。因此，到小室蓋片的最佳焦距將變得比較大，這使得工作距離較短的油浸式物鏡不適合通過蓋玻片/間室、培養基/緩沖液對細胞/組織成像。
此外，使用油浸式物鏡來觀察水性培養基內的細胞時還會增加額外的折射問題，因為油和水的折射率不同。
觀察間室內的活細胞時，光路將遇到不同的折射率。間室/蓋玻片的材料和覆蓋細胞或組織的水性培養基之間存在不同的折射率。從標本圖像中傳出的光將在每個階段發生折射而導致球面像差。
圖7：可以調節物鏡的校正環以適配不同厚度的蓋玻片。電動校正環可優化設置，把干擾降低到最小。
水浸式共聚焦顯微鏡
最后，水浸式物鏡最為適合的應用之一是活細胞的共聚焦成像，因此水浸式物鏡通常是許多共焦系統的標配。由于水與油相比粘度較低，使用這些物鏡可降低對蓋玻片的表面張力，這意味著標本發生移位的可能性較小，尤其是在采集Z軸疊加的過程中。
甘油浸沒式物鏡
圖8：對于使用折射率接近于甘油/水混合物的封片劑（如VECTASHIELD® Hard+SetTM）樣本，甘油物鏡是較佳選擇。
甘油是另一種浸沒介質。很多固定樣本都使用Mowiol、Vectashield或類似的甘油基封片劑封片（見表1）。這些介質的折射率接近于80/20 甘油/水混合溶液的折射率（RI=1.45）。對于此類封片劑封片標本，甘油物鏡（見圖8）是最佳選擇。
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