圖1 PCL單細胞圖譜

2. 細胞模塊分析揭示了5種TIME亞型
為了研究PLC的TIME亞型，作者檢測了腫瘤組織細胞的共富集模式。層次聚類識別出5個穩定的細胞模塊(CM1-CM5)(圖2a)，作者將患者分為5個相應的TIME亞型(圖2b-e)，并從以下4個方面對每個亞型做了具體分析:(1)細胞組成，(2)功能標記基因表達，(3)時間相關基因特征，(4)預后相關性。

CM1中含有活化的骨髓細胞和T細胞簇，CM1優勢患者表現出免疫激活狀態，因此被指定為TIME-IA(免疫激活)。CM2中與免疫抑制富集的“骨髓細胞免疫抑制”和“促腫瘤細胞因子”特征有關，并且與較差的預后相關，被指定為TIME-ISM(免疫抑制髓系)。基質細胞均在CM3和CM4中富集。CM3中高表達腫瘤激活的基質基因，預后較差，指定為TIME-ISS(免疫抑制基質)。而CM4含有大量內皮和間充質細胞，缺乏免疫細胞，被命名為免疫排斥表型(TIME-IE)。CM5含有肝駐留細胞簇，包括駐留型自然殺傷細胞(NK_05_CD160) Kupffer細胞(Mph_01_MARCO)和肝竇內皮細胞(EC_01_CLEC4A)，與較好的預后相關。因此，CM5優勢患者被指定為TIME-IR(免疫駐留)。這些TIME亞型表現出不同的趨化因子網絡，并與腫瘤細胞的不同體細胞突變和轉錄組譜相關。

作者將以上分類方案命名為TIMELASER，用于區分腫瘤免疫微環境亞型。將這種分類方法應用于空間轉錄組數據和已發表的scRNA-seq、bulk RNA-seq數據集，均能得到與本文相似的TIME亞型。這些結果驗證了本文提出的TIMELASER分類法，并進一步證明該分類法在空間分辨率和bulkRNA數據分析上的有效性。
 

圖2解析PCL的5種TIME亞型

3. 肝癌中性粒細胞異質性
由于中性粒細胞比較脆弱，基因含量少，單細胞測序中難以捕獲，而TIME-ISM（CM2）中多種中性粒細胞亞群的富集、與不良預后的關聯促使作者進一步研究中性粒細胞。34,307個中性粒細胞被分為11個亞群，這些亞群表現出明確的組織分離和癌癥類型偏好，主要可分為外周血中性粒細胞(PBNs)、鄰近肝臟中性粒細胞(ALNs)、腫瘤中富集的中性粒細胞（TANs）。擬時序分析揭示了中性粒細胞從PBN到ALN再到TAN的明確分化路徑(圖3a)。

值得注意的是，TIME-ISM中三個TAN亞群的組合比例較高(Neu_09/10/11，平均占總TAN的86.8%)，與較差的預后相關，暗示這些TAN具有促腫瘤功能。作者重點關注了兩個TANs亞群Neu_11_CCL4和Neu_09_IFIT1的表型和功能。通過mIHC證實，CCL4+ TANs (Neu_11_CCL4)高表達趨化因子相關基因CCL3和CCL4(圖3d)。一系列體外實驗證實TANs具有趨化因子分泌功能，支持CCL4+ TANs可以招募巨噬細胞的觀點。作者還發現，與非TANs相比，TANs中CD274(編碼PD-L1)的表達顯著增加，其中Neu_09_IFIT1的表達量最高(圖3i)。為了研究高PD-L1表達的TANs是否會直接抑制T細胞活性，作者將CD8+ T細胞與體外誘導的TANs或患者衍生的TANs共培養。與體外誘導的TANs共培養的CD8+ T細胞中，T細胞細胞毒性標記物IFNγ和活化標記物CD25和CD69的蛋白水平降低(圖3n)。在加入抗PD-L1抗體后， IFNγ的下降被逆轉(圖3o)，證實PD-L1介導了TANs的抑制功能。
 

圖3中性粒細胞異質性

4. 人類和小鼠肝癌中的保守中性粒細胞亞群
為了進一步研究TANs的異質性，作者建立了兩種新的自發性肝癌小鼠模型，pTMC小鼠主要發展為HCC, pTMK小鼠主要發展為ICC。作者對來自6只小鼠的21個樣本進行了scRNA-seq分析，包括外周血、腫瘤鄰近肝臟和腫瘤。17,780個中性粒細胞被分為12個簇，顯示出明確的組織特異性和有序的發育軌跡(圖4a、b)。TIME-ISM (hNeu_09/10/11)中的三個TAN子集分別對應于mNeu_10/11/12。Cd274在小鼠TANs高表達，與人類TANs一致(圖4d)。通過無偏倚的整合跨物種數據，分析關鍵特征基因，作者發現小鼠和人的中性粒細胞在很大程度上保守(圖4c)，這一發現為在小鼠模型中研究中性粒細胞為基礎的治療奠定了基礎。
 

圖4 小鼠模型中的中性粒細胞異質性

5. 中性粒細胞耗竭延緩腫瘤生長
由于TIME-ISM TANs的促腫瘤表型(Neu_09/10/11)，作者進一步探究了在體內消除這些促腫瘤TANs亞群的治療效果。使用抗ly6g抗體消耗中性粒細胞后，患癌小鼠的肝癌結節和腫瘤重量顯著減少(圖4e,f)。與同型對照相比，抗ly6g處理后的TANs數量和TANs的PD-L1表達均下降(圖4)。此外，作者觀察到浸潤性巨噬細胞減少46.6%。雖然Ly6G阻斷并沒有改變CD8+ T細胞的數量，但它們的衰竭狀態得到了緩解。總的來說，中性粒細胞耗竭可以減弱巨噬細胞募集和T細胞抑制，從而抑制腫瘤生長。

結論
本研究通過大規模，免分選的單細胞分析全面描繪了PLC的細胞圖譜，識別到五種TIME亞型，解析了中性粒細胞異質性。TIMELASER框架涵蓋了大多數細胞群，可對TIME亞型無偏分類。作者推測，對這些數據的深入分析，將為腫瘤- TIME和TIME-TIME串擾提供新的見解，有助于識別免疫細胞功能，指導我們去發現PCL的生物標志物或免疫治療靶點。本文深入研究了中性粒細胞的異質性及其功能，確定了人類和小鼠之間廣泛保守的中性粒細胞譜。TANs具有促腫瘤作用，作者推測CCL4+、SPP1+和PD-L1+ TANs是有希望的免疫治療靶點。進一步探索中性粒細胞對免疫治療的影響及其相關的臨床混雜因素，將為更好地了解TAN生物學特性，提出肝癌治療的轉化研究途徑提供新的機會。

參考文獻：
[1] Xue R, Zhang Q, Cao Q, et al (2022) Liver tumour immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity. Nature 612:141–147. https://doi.org/10.1038/s41586-022-05400-x