熒光技術的原理及其在顯微鏡領域的應用
以熒光為工具在顯微鏡中的應用
熒光在顯微鏡中有著廣泛的應用，是觀察特定分子分布的重要工具。細胞中的絕大多數分子并不會發出熒光，因此必須用熒光分子即所謂的熒光素進行標記。對于感興趣的分子可以直接標記（例如，用DAPI標記DNA），或者使用可與特異性抗體偶聯的熒光素進行免疫染色。免疫染色時通常必須對細胞進行固定。
熒光顯微鏡還可對活細胞或組織進行延時成像。為此，對于感興趣的蛋白質可以使用基因編碼的熒光分子進行標記，如GFP（綠色熒光蛋白）。對于感興趣的分子（如Ca2+）還可以使用可逆結合的合成染料（如fura-2）或轉基因天然蛋白質（如GFP衍生物）進行標記。
圖1：當特定波長（激發波長）的光照射到分子上（例如照射到熒光團中）時，光子會被分子的電子吸收。然后，電子從它們的基態(S0)提升到更高的能級，即激發態(S1’)。這個過程被稱為激發(1)。激發態壽命很短(通常為10-9/-10-8秒)，在此期間電子的一些能量會丟失(2)。當電子離開激發態(S1)返回基態(3)時，它們會失去在激發過程中獲得的剩余能量。熒光團的獲得的能量會以光子形式釋放，釋放的光子波長以比激發光波長更長，從而能量更少。這種現象被稱為斯托克斯位移。
圖2：COS 7細胞，綠色：無特征蛋白質，GFP，紅色：α-微管蛋白，Cy3，藍色：細胞核，DAPI。感謝中國上海SIBS、CAS、生物化學與細胞生物學研究所邊瑋提供的圖片。
圖3：小鼠成纖維細胞，綠色：F-肌動蛋白，FITC，紅色：微管蛋白，Cy5，藍色：細胞核，DAPI。感謝德國海德堡Max Planck醫學研究所Günter Giese博士提供的圖片。
圖4：小鼠原代海馬神經元細胞，藍色：轉染細胞標記；綠色：肌動蛋白，TRITC；紅色：GluA Ampa受體單位，Texas Red；灰色：突觸小泡蛋白，Cy 5
圖5：果蠅幼蟲，綠色：RNA結合蛋白，Alexa 488
由于磷光分子發光的時間比熒光素長得多，因此它們儲存激發能量的方式肯定有所不同。這種差異的基礎在于兩種形式的激發能級，即單重激發態和三重激發態都基于不同的自旋排列。
自旋是電子的一種屬性。簡單來說，自旋描述了由電子旋轉引起的角動量。電子的自旋方向可以是正方向（+1/2），也可以是負方向（−1/2）。更高能級的自旋配對可以在相互方向上平行或反平行。在反平行自旋配對中，單個角動量相互補償，同時自旋總值為零。這種自旋排列就稱為單重態。兩種平行自旋互不補償且所得數值不同于零值，在這種情況下，自旋被稱為三重態。
當電子從單重態激發態回到基態時，就會產生熒光。但在某些分子中，被激發電子的自旋可以在一種稱為系統間交叉的過程中轉換為三重態。這些電子失去能量，直到它們處于三重基態。這種態比基態具有更高的能量，但也比單重態激發態具有更低的能量。因此，電子無法切換回單重態，也不能輕易地返回基態，因為量子力學只允許自旋總值為零。因此分子被困在其能量狀態當中。
但從三重基態到基態的一些變化有時還是有可能的。這些變化會發射出光子和磷光。由于一次只有少數事件可能發生，三重基態呈現為能量儲庫的形式，因此能夠在更長的一段時間內發出磷光。
對于顯微鏡，熒光是最為實用的一種冷發光。熒光素可以很容易地通過特定的光源（如燈和濾光系統或激光器）在特定波長下激發，發射光和激發光可以通過波長來加以區分（斯托克斯位移）。
利用熒光成像，實驗室人員可以對細胞內的分子數量和位置進行特征描述。熒光顯微鏡的另一個優點是可以同時使用幾種熒光素。熒光素只需其激發和發射波長不同即可。因此，不同目標分子均可同時觀察并開展大量的實驗，例如開展共定位的研究等。
圖6：果蠅，幼蟲齡期，綠色：Feb211陽性神經元及其軸突，Alexa 488；紅色：CNS纖維部分（即所有軸突），Cy3；藍色：細胞核，DAPI。感謝德國Eggenstein-Leopoldshafen毒理學與遺傳基因研究所，Karlsruhe研究所Christoph Melcher博士提供的圖片。
圖7：小鼠腎臟切片，綠色：腎小球和腎曲小管，Alexa 488 WGA；紅色：F-肌動蛋白（普遍存在于腎小球和刷狀緣）；藍色：細胞核，DAPI
圖8：新生心肌細胞，黃色：DNA，DAPI；綠色：肌間蛋白，Cy3；紅色：鈣粘蛋白，Texas Red；藍色：肌動蛋白，Alexa 633
圖9：熒光顯微鏡下獲得的分裂中期FISH染色染色體。感謝東京大學前沿科學研究生院人類進化實驗室Yumiko Suto博士提供的圖片。
STELLARIS 5 & STELLARIS 8 共聚焦顯微鏡平臺
Leica M205 FA 和 Leica M205 FCA
了解更多：徠卡顯微
