準父母的主要關注點是胎兒和新生兒的成長和健康。一般而言，母代暴露于空氣污染、農藥和被動吸煙等環境因素與出生結局相關，如低出生體重(low birth weight infant，LBW)、早產(preterm birth, PTB)和小于胎齡(small for gestational age，SGA)。受精卵產生需要精子和卵子結合，因此父代作用不容忽視。作為將父系遺傳信息傳遞給子代的重要載體，精子在這一關聯中發揮著至關重要的作用。越來越多的動物研究強調，孕前父代身體狀況(如肥胖和年齡)可以通過表觀遺傳調控影響子代健康；父代暴露于不良環境因素也會影響子代發育。然而關于父代不良環境暴露對子代健康結局影響的流行病學研究數量有限。空氣污染作為一種常見的環境危險因素，其健康風險不容低估，母代暴露于空氣污染可導致不良出生結局。此外還應研究人群動態復雜的生活環境、空氣污染聯合暴露的影響。短期和長期暴露于空氣污染會影響育齡男性的精液質量。精子DNA中5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5-hmC)水平發生變化，提示了與精子DNA甲基化相關機制。因此，了解孕前父代空氣污染暴露對子代出生結局的影響將拓寬對父代作用的認識。
 
2023年12月15日，南京醫科大學夏彥愷教授和吳煒教授為共同通訊作者在《Environmental Research》雜志發表題為“Alterations in sperm DNA methylation may as a mediator of paternal air pollution exposure and offspring birth outcomes: Insight from a birth cohort study”的研究論文，該研究以精子為研究對象，通過精子DNA甲基化分析等揭示了父代空氣污染暴露與子代出生結局的關聯及精子DNA甲基化在其中的作用。
 

標題：Alterations in sperm DNA methylation may as a mediator of paternal air pollution exposure and offspring birth outcomes: Insight from a birth cohort study（精子DNA甲基化變化可能是父代空氣污染暴露和子代出生結局的中介：來自出生隊列研究的見解）
時間：2023-12-15
期刊：Environmental Research（環境研究）
影響因子：IF 8.3
技術平臺： RRBS等
 
研究摘要：
父代暴露于環境危險因素影響子代健康。本研究旨在分析精子DNA甲基化介導的父代空氣污染暴露與子代不良出生結局之間的相關性。從2014年到2016年，研究人員招募了1607名育齡男性及其配偶，采集精液樣本進行精子DNA甲基化分析。采用多元線性回歸（Multivariate linear regression）和加權分位數(Weighted Quantile Sum, WQS)回歸模型分析父代空氣污染暴露與子代出生結局的相關性，鑒定出一個關鍵暴露窗口。采用RRBS（Reduced representation bisulfite sequencing）方法分析了精子DNA甲基化，結果表明，父代在PM 2.5（β =−211.31，95% CI:(- 386.37，- 36.24)）、PM 10（β =−178.20, 95% CI:(- 277.13，- 79.27)）和NO2（β = - 84.22, 95% CI:(- 165.86， - 2.57)）中高暴露與子代出生體重呈負相關，尤其在男嬰中。受精前15 ~ 69 天早期暴露窗口是關鍵暴露窗口，會增加低出生體重和小于胎齡的風險。父代共同暴露于六種空氣污染物會導致較低的出生體重(β = - 51.91, 95% CI:(- 92.72，-11.10))和減少胎齡(β = - 1.72, 95% CI:(- 3.26， - 0.17))，其中pm2.5是最加權污染物。父代空氣污染暴露導致10 328個差異甲基化區域，其中IGF2R基因是參與表觀遺傳過程的關鍵基因。這些差異甲基化基因主要與蛋白質結合、轉錄調控和DNA模板（DNA template）相關。總之結果表明，精子發生是父代暴露于空氣污染影響精子DNA甲基化和子代出生結局的易感窗口期。
 
材料方法：
（1）研究人群
所有參與者均來自南京醫科大學生育與環境縱向調查（NMU-LIFE）隊列，2014~2016年，1607名孕婦及其丈夫和孩子參加本研究，采集生物樣本如血液、胎盤和精液。最終分析中包括 1267 名參與者。

（2）個體暴露評估
精子發育大約需要 90 天，父代空氣污染暴露窗口為受精前 90 天。受精日期計算為末次月經后15天。90天劃分精子發育四個關鍵時期：0-9天（附睪中貯存）、10-14天（精子活力發育）、15-69天（精子發生階段Ⅱ）和 70-90 天（精子發生階段Ⅰ）。5個暴露窗口來區分關鍵時期，使用反向距離加權 （IDW） 模型進行分析。此外從中國空氣污染跟蹤（TAP）網站獲取了2013年1月1日至2016年12月31日期間PM2.5化學成分的日濃度，包括有機物（OM）、硫酸鹽（SO4^2-）、銨（NH4⁺）、黑炭（BC）和硝酸鹽（NO3^-）。將來自空氣監測站的個人住址和六種空氣污染物的每日濃度結合起來，使用IDW方法分析個體暴露水平。

（3）出生結局
研究主要檢查出生體重和胎齡：低出生體重（LBW）、早產（PTB）和小于胎齡（SGA）。

（4）協變量分析（Covariates）
潛在的混雜因素與出生結局和空氣污染濃度有關。

• 親本變量包括父母年齡（連續）、體重指數（BMI）（<18.5、18.5-24、24-28或>28 kg/m2）、吸煙和飲酒狀況（從未或曾經）、家庭收入（<10萬元/年、10-20萬元/年或≥20萬元/年）、文化程度（中學及以下、高中及中學、大學及以上）。
• 氣溫是影響空氣污染濃度的一個氣象因子。
• 胎兒性別。
• 根據胎齡對父代空氣污染暴露與出生體重/LBW之間相關性分析。
• 考慮到孕期母代空氣污染暴露，對父代暴露于不同空氣污染物模型進行母代空氣污染暴露調整。

（5）統計分析
男性參與者的人口統計信息及其子代出生結局。分析不同暴露窗口期間的空氣污染暴露水平，利用邏輯和多元線性回歸來分析父代空氣污染暴露與整體人群的五個出生結局之間的相關性。

（6）精子DNA甲基化分析
選擇10名提供精液樣本的男性，并根據前述WQS分析中確定的最大加權空氣污染物的個體暴露水平分為兩組。一組為暴露于高水平空氣污染參與者，另一組為暴露于低水平空氣污染參與者。兩組的10名男性年齡范圍為25 ~ 35歲，均不吸煙，BMI正常。采用簡化基因組亞硫酸鹽測序(Reduced representation bisulfite sequencing, RRBS)技術分析精子DNA甲基化。從NCBI hg19基因組注釋數據庫下載了Refseq基因數據。采用Metilene軟件分析差異甲基化區域(differentially methylated regions, DMRs)。采用Mann-Whitney U檢驗和二維Kolmogorov-Smirnov檢驗鑒定兩組間的DMRs (P< 0.05)，并將DMRs比對至注釋的人類基因組。最后使用DAVID軟件進行KEGG和GO通路富集分析。

關鍵研究結果：
使用RRBS進行的全基因組DNA甲基化分析鑒定出兩組的10328個DMRs(圖5A)。DMRs的中位長度為102 bp(圖5B)。在DNA甲基化的方向和水平上，與PM2.5低暴露相比，PM2.5高暴露導致高甲基化(3,803)和低甲基化(6,525)DMRs(圖5C)。為了分析高PM2.5誘導的精子DMRs生物學過程，研究人員將轉錄起始位點上游1500 bp和下游500 bp范圍內的DMRs進行功能富集分析。篩選出Q值(多重校正p值)< 0.05的通路，共390條。隨后分析了與空氣污染相關的DMRs是否與注釋的基因組特征重疊。根據人類DNA ENCODE數據，與空氣污染相關的DMRs與順式調節區域(DHSs、增強子和TFBS)顯著重疊(圖5D)，且與增強子重疊的DMR多于啟動子。綜上所述，空氣污染相關的DNA甲基化變化主要發生在遠端調控區，并可能影響基因表達。圖5E給出了對應聚類標注的GO相似性熱圖，主要聚類為細胞生物過程、離子轉運和生物調節。圖5F顯示了最顯著Q值的前15條通路。其中最重要的功能通路是"蛋白結合（protein binding）"，在該通路中觀察到胰島素樣生長因子受體2 (IGF2R)基因。圖5G顯示相應突變體中IGF2R周圍的甲基化率降低。
 

圖5：父代空氣污染暴露對精子DNA甲基化的影響

1. 高暴露組和低暴露組之間的差異甲基化區域(DMR)。
2. DMR長度分布。
3. DMR甲基化在兩組間的分布。
4. DMR或對應的調控區與人類ENCODE數據中的順式調節區的重疊百分比。
5. 100個隨機GO分析的相似性熱圖，已進行聚類和注釋。
6. DMR的GO富集分析。
7. DMR中IGF2R周圍結構的可視化。

研究小結：
本研究表明，父代空氣污染暴露介導的精子DNA甲基化表觀遺傳會影響子代出生結局。此外，精子發生的早期階段是暴露期的關鍵窗口期。本研究揭示了父代暴露對子代健康狀況的影響，并提出了表觀遺傳重編程機制的可能性。需要進一步研究來分析其潛在的機制，并驗證本研究結果的意義。

參考文獻：
Cheng Y, Feng J, Wang J, Zhou Y, Bai S, Tang Q, Li J, Pan F, Xu Q, Lu C, Wu W, Xia Y. Alterations in sperm DNA methylation may as a mediator of paternal air pollution exposure and offspring birth outcomes: Insight from a birth cohort study. Environ Res. 2023 Dec 14:117941. pii: S0013-9351(23)02745-7. doi: 10.1016/j.envres.2023.117941. PubMed PMID: 38103775.