紅外(IR)光譜在酵母和細菌快速菌株分型方面的應用
用于菌株分型和鑒別的光譜檢測解決方案
紅外(IR)光譜展示了其在酵母和細菌快速菌株分型方面的應用前景，該方法有助于改善醫療保健機構積極主動的感染控制策略。
作者
Margie Morgan博士，Cedars-Sinai醫學中心病理和檢驗醫學科臨床微生物學醫學主任
Deisy Contreras博士，Cedars-Sinai醫學中心病理和檢驗醫學科臨床微生物實驗室臨床副主任
Markus Meyer博士，布魯克微生物與感染診斷部門 衛生與流行病事業部主管
引言
微生物耐藥性(AMR)是人類面臨的最大公共衛生威脅之一。1AMR不僅每年造成120多萬人死亡，2還帶來巨大的經濟損失，并與疾病相關的發病率有關。盡管一些超級細菌已經成為著名的耐藥微生物——比如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和淋病奈瑟菌——但實際問題遠比這些臭名昭著的案例更為嚴重，且感染也并不局限于細菌感染。
耳念珠菌是2009年在日本首次報道的一種酵母菌，3但對韓國血液分離株的回顧性分析表明，最早的已知病例發生在1996年。4今天，耳念珠菌可以危及生命，并已蔓延到六大洲的30多個國家5。耳念珠菌通常對所有三大類抗真菌藥物(唑類、多烯類和棘白菌素類)都具有耐藥性，并且很容易通過定植患者和受污染的表面和設備等途徑在醫院環境中傳播。
2015年，美國首次報道了耳念珠菌。2020年7月，僅洛杉磯就累計發生了1000多例病例。6像在美國發生的耳念珠菌這樣的多重耐藥微生物的爆發表明，醫療機構需要能夠快速識別微生物菌種的儀器，以便為正確的行動方針提供信息。
分型技術
傳統的菌株分型技術，如脈沖場凝膠電泳、多位點序列分型、乳膠凝集和全基因組測序，需要耗費大量的時間和資源，而且不是所有的微生物實驗室都已經具備這些技術。
易于應用的分型方法是快速可靠地表征耐藥微生物的核心，而基于傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)的菌株分型技術正顯示出很好的應用前景。與傳統的方法相比，FT-IR使用相對簡單，可實現高通量的菌株區分，每份樣品的分析成本較低。FT-IR測量與紅外光吸收有關的分子振動，不同化學結構的振動頻率不同——例如，脂肪酸和脂質中的羧基振動頻率為2800-3000 cm-1，而蛋白質中的酰胺基振動頻率為1500-1800 cm-1。FT-IR通過測量整個波數范圍內的吸收光譜來產生樣品的分子指紋。微生物可以通過指紋圖譜的變化進行分類，特別是多糖的吸收區域，這部分光譜提供了許多分子(如膜糖蛋白)中都存在的多糖結構信息。
明確的菌種鑒定
FT-IR技術可以與基質輔助激光解吸/電離飛行時間(MALDI-TOF)質譜技術相結合，同時用于微生物的鑒定。
基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)是一種可靠的技術，可用于直接對培養皿或患者血液培養物中的微生物進行種屬水平的鑒定。通過主要分析核糖體蛋白，MALDI-TOF MS可以確定微生物獨特的蛋白質指紋圖譜，然后將得到的指紋圖譜與參考庫匹配來進行鑒定。強大且高性能的MALDI-TOF MS系統是最新技術發展的成果，它可以識別數千種微生物；有些可以在相同的工作流程中識別AMR的特定標志峰或活性。與傳統的鑒定方法相比，7MALDI-TOF MS具有更高的準確性，獲得結果的時間更快，成本更低，7因此在許多微生物實驗室中得到了常規使用。
Cedars-Sinai醫學中心的微生物鑒定及菌株鑒別
Cedars-Sinai醫學中心是一個非營利的研究型醫療機構，服務于洛杉磯及其周邊地區，該中心采取了綜合措施來應對耳念珠菌的挑戰。由于耳念珠菌與其它念珠菌有相似的特征，因此用傳統方法或最新的熒光和生化檢測方法都難以鑒定。因此，Cedars-Sinai的研究人員將注意力轉向了能將耳念珠菌區分出來的創新方法，包括下一代測序法、紅外光譜法和MALDI-TOF質譜法。
Cedars-Sinai醫學中心所做的工作幫助引導了MS和IR兩種方法在加州的臨床應用，它是加州首個采購MALDI-TOF 質譜的實驗室，通過質譜可在菌種水平上明確鑒定耳念珠菌。Cedars-Sinai也是美國首個將全新的FT-IR光譜系統用于更深入的菌株分型的醫學中心。起初，他們主要將FT-IR光譜系統用于革蘭氏陰性桿菌(如銅綠假單胞菌)和革蘭氏陽性球菌(如金黃色葡萄球菌)的爆發分析，之后開始用于耳念珠菌的菌株分型和分類。
2019年，紅外光譜就已成為Cedars-Sinai醫學中心常規檢測耳念珠菌的一種成熟方法，但COVID-19的出現給研究帶來了前所未有的障礙，包括對旅行和進入實驗室的限制。到2020年底，大部分資金都被用于抗擊SARS-CoV-2（這是可以理解的），雖然該中心剛剛宣布，多重耐藥耳念珠菌是醫院和長期護理機構的重大威脅。Cedars-Sinai醫學中心的研究人員決心建立一種檢測耳念珠菌的方法，通過在入院前對高危患者進行檢測來預防傳播。
耳念珠菌的兩步檢測法
Cedars-Sinai的研究團隊采取逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)來鑒定耳念珠菌，以進行有價值的篩查，但為實現更高水平的監控，還需要進一步的檢測。今天，Cedars-Sinai的研究人員采用兩步檢測法來診斷耳念珠菌。第一步:使用RT-PCR技術通過腋窩或腹股溝拭子檢測耳念珠菌；RT-PCR的速度及其無需分離耳念珠菌的優點，使研究人員能夠快速識別有風險的患者，并對其采取適當的隔離措施。第二步: 培養菌株，并通過紅外光譜進行菌株分型。
該系統可將不同的念珠菌和其它酵母菌區分開來，可作為指導臨床決策的早期預警系統。Cedars-Sinai的研究人員已從中看到了希望：最近他們使用了上述兩步系統，在一年的時間里，從700多名高危患者中鑒定出28個耳念珠菌陽性標本，相當于4%的陽性率。8
該研究所已經建立了一個數據庫，記錄了Cedars-Sinai收治的每位耳念珠菌陽性的患者。這一寶貴資源將有助于迅速查明未來可能發生的疫情。
沙門氏菌鑒定
Cedars-Sinai的研究人員還利用MALDI-TOF質譜鑒定了自體干細胞移植患者的干細胞培養物中的沙門氏菌。9沙門氏菌感染是導致急性腹瀉的主要原因，其臨床表現從腸胃炎到危及生命的發燒。10發達國家近年來多次暴發的主要感染源是食物(通常是雞蛋、肉類、乳制品和蔬菜)和水。2019年，美國爆發了兩次重大疫情：一次是由家禽接觸引起的，另一次是由新鮮蔬菜引起的。兩次疫情都導致了1000多例病例，前一次疫情蔓延到49個州。11沙門氏菌在醫院的爆發會導致嚴重的疾病和死亡。
Cedars-Sinai的異常沙門氏菌培養物取自兩名接受外周干細胞采集術的患者。患者均為女性，年齡為65歲和45歲，分別有多發性骨髓瘤和再生障礙性貧血病史。兩名患者在兩個不同采集日的培養物均為D群沙門氏菌陽性，但這些培養物表現出不同的聚類和藥物敏感性。后續的FT-IR分析在兩個患者的樣本中識別出不同亞種的腸道沙門氏菌，解釋了前述現象。12 兩位患者極不可能具有共同的感染源，也顯然沒有嚴重的沙門氏菌相關感染。
展望未來
憑借開創性的醫學研究成果，定義醫療保健的教育計劃和廣泛的社區利益，Cedars-Sinai正為患者護理的質量和創新設立新的標準。繼耳念珠菌和沙門氏菌的分型工作取得成功之后，Cedars-Sinai研究團隊目前正在評估FT-IR識別膿腫分枝桿菌亞種的潛力。該信息可用于預測細菌的克拉霉素耐藥性；因此，該技術應用的批準生效將有助于實現菌株實時分型，縮短獲得克拉霉素最終藥敏結果所需的時間。
驅動快速疾病檢測和知情決策的創新儀器，將成為醫療機構有效分析和管理流行病的必要基礎。新興的挑戰要求對現有工具進行評估，以應對未來醫療保健領域的挑戰。
作者簡介
Margie Morgan博士是Cedars-Sinai醫學中心病理和檢驗醫學科臨床微生物學醫學主任。Morgan博士負責微生物實驗室的臨床測試，指導55名員工執行診斷測試，為住院醫生和同事提供教學服務，并參與微生物學新診斷技術的研究。
Deisy Contreras博士是Cedars-Sinai醫學中心病理和檢驗醫學科臨床微生物實驗室臨床副主任。Contreras博士主要研究新診斷技術及其在臨床實驗室中的應用。
Markus Meyer博士是Bruker Daltonics公司(位于德國不來梅) 微生物與感染診斷(MID)部門衛生/流行病學事業部主管。他2010年加入Bruker Daltonics公司，擔任各種生命科學質譜儀器的產品經理，之后于2018年加入微生物與感染診斷部門，擔任全球耗材的產品經理。
參考文獻
1 World Health Organization (WHO), Antimicrobial resistance, November 17th, 2021. Accessed April 2023. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antimicrobial-resistance
2 Antimicrobial Resistance Collaborators, “Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis”, The Lancet, vol 399(10325) 629-655, January 19th, 2022.
3 Satoh K, et al., “Candida auris sp., a novel ascomycetous yeast isolated from the external ear canal of an inpatient in a Japanese hospital.” Microbiology and immunology, vol 53(1) 41–44, January 2009.
4 Lee W.G, et al, “First three reported cases of nosocomial fungemia caused by Candida auris”, Journal of clinical microbiology, vol 49(9) 3139–3142, June 29th, 2011.
5 Rhodes J, Fisher M.C, “Global epidemiology of emerging Candida auris”, current opinion in microbiology, vol 52 84–89, July 3rd, 2019.
6 County of Los Angeles Public Health, “Mitigating the Spread of Candida auris in Los Angeles Country”, July 2nd, 2022. Accessed April 2023. http://publichealth.lacounty.gov/acd/docs/MitigatingSpreadofC.aurisLAC.pdf
7 Schulthess B, et al, “Use of the Bruker MALDI Biotyper for identification of molds in the clinical mycology laboratory”, Journal of clinical microbiology, vol 52(8) 2797–2803, June 2013.
8 Contreras D.A, Morgan M.A, “Surveillance disgnostic algorithm using real-time PCR assay and strain typing method development to assist with the control of C.auris amid COVID-19 pandemic”, Frontier Cell Infection Microbiology, vol 12 887754, August 31st, 2022.
9 Faron M.L, et al, “Multicenter evaluation of the Bruker MALDI Biotyper CA system for the identification of clinical aerobic gram-negative bacterial isolates”, PLOS ONE, vol 10(11) e0141350, November 3rd, 2015.
10Popa G.L, Papa M.I, “Salmonella spp. Infection – a continuous threat worldwide”, Germs, vol 11(1) 88-96, March 15th, 2021.
11Phou S, et al, “Successful autologous hematopoietic stem cell transplants using salmonella positive products collected from asymptomatic donors”, Transfusion, vol 63(4) 861-866, March 7th, 2023.
12 Popa G.L, Papa M.I, “Salmonella spp. Infection – a continuous threat worldwide”, Germs, vol 11(1) 88-96, March 15th, 2021.
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com