一、什么是基因編輯？

基因編輯是指通過基因編輯技術對生物體基因組特定目標進行修飾的過程，可以精確地定位到基因組的某一位點上，在該位點上可以進行特定DNA片段的插入、缺失、修改和替換，從而改變其遺傳信息和表現型特征，最終應用于人類疾病治療、農業生產、基因功能研究等多個領域。

基因編輯技術主要分為基因敲除、基因插入、基因突變和基因重組等四種技術。其中，基因敲除技術是最常用的，它的原理是通過CRISPR/Cas9等基因切割工具，將某個基因的特定序列剪切掉，使其失去功能，從而達到改變物種特征的目的。基因插入技術則是將外源基因插入到特定位置，使其成為物種的一部分，從而改變物種的特征�；�因突變技術是指通過基因編輯技術，引入一定的突變，使基因的功能發生改變，從而改變物種的特征。最后，基因重組技術則是通過對基因的重組，改變基因的結構，從而達到改變物種特征的目的。

基因編輯技術發展迅速，其中CRISPR-Cas9技術是最常用的基因編輯工具之一，已經在許多生物體中實現了基因編輯。這項技術的出現為許多遺傳性疾病的治療帶來了希望，同時也在農業、生態學等領域展現出了巨大的應用潛力。

 

二、基本步驟

基因編輯的過程通常包括以下步驟：

1. 選取目標基因：根據研究需求選擇特定的基因作為目標基因。

2. 設計基因編輯器：根據目標基因的特點，設計相應的基因編輯器，包括指導RNA和Cas9蛋白等。

3. 導入基因編輯器：將基因編輯器導入到生物體內，使其能夠準確地找到目標基因。

4. 激活基因編輯器：在合適的時間和條件下，激活基因編輯器，使其能夠對目標基因進行修飾。

5. 檢測和驗證：對經過基因編輯的生物體進行檢測和驗證，確認基因編輯是否成功，并評估其表型和遺傳變化。

 

三、基因編輯器是什么？

基因編輯器是指用于對生物體基因組進行修飾和改造的工具，其中最常見的是CRISPR-Cas9系統。

CRISPR-Cas9系統由兩部分組成：Cas9蛋白和指導RNA（sgRNA）。其中，Cas9蛋白是一種能夠切割DNA的酶，而指導RNA則能夠引導Cas9蛋白找到目標基因組序列并對其進行切割。通過設計特定的指導RNA，可以實現對目標基因組的定點修飾，包括插入、缺失、修改和替換等操作。

除了CRISPR-Cas9系統外，還有其他類型的基因編輯器，如ZFNs（鋅指核酸酶）和TALENs（轉錄激活子樣效應物核酸酶）等。這些基因編輯器也都是通過對目標基因組進行修飾，從而實現改變生物體遺傳信息和表現型特征的目的。

 

四、 基因編輯中的CRISPR技術是什么？

CRISPR技術是一種基因編輯技術，可以用來對生物體的基因進行精確的編輯。該技術的中文名是“基因剪刀”。

CRISPR-Cas9系統是由兩部分組成的：一個是向導RNA，它能夠精確地找到目標基因，另一個是Cas9蛋白，它就像一個精準的剪刀，能夠將目標基因準確地剪切下來。

首先，向導RNA與Cas9蛋白結合，形成一個復合體。然后，這個復合體被引導到目標基因的位置。Cas9蛋白會與目標基因結合，并剪切下這段基因。

剪切下來的基因可以被科學家重新編輯，比如替換某個堿基對、插入新的基因序列或者刪除某個基因片段。一旦編輯完成，新的基因序列會被引導回原來的位置，并插入到原來的基因組中。

CRISPR-Cas9技術的優點在于它的高精度和高效率。與之前的基因編輯技術相比，CRISPR-Cas9技術可以更準確地找到目標基因，并且可以更高效地編輯基因。

此外，CRISPR-Cas9技術也具有廣泛的應用前景。它不僅可以用于治療遺傳性疾病，還可以用于治療癌癥、神經性疾病以及其它許多疾病。

 

五、 向導RNA有哪些？

1. sgRNA（單向導RNA）：sgRNA是CRISPR-Cas9基因編輯工具中的一種特殊類型的向導RNA。它通過將crRNA和tracrRNA融合為一條單一的RNA分子，提高效率和便于生產。sgRNA 5′端20 bp序列是與靶序列互補配對的序列，如果編輯某個靶位點，只需要改變這20 bp的序列就可以實現。

2. crRNA（向導RNA的靶向序列）：在CRISPR-Cas9系統中，crRNA主要負責提供與目標基因互補配對的序列。這個序列全長并不與Cas9蛋白結合，只有其中20nt的部分序列在Cas9蛋白剪切DNA時提供目標序列的信息。

3. tracrRNA（向導RNA的非特異性導向序列）：tracrRNA主要與Cas9蛋白結合并形成復合物，幫助Cas9蛋白尋找目標基因。其主要功能是提供一種"通用"的導向序列，與不同的crRNA配對，以實現對多種基因進行編輯。

此外，某些文獻中還提到了一種叫做Alt-R® CRISPR-Cas9系統的向導RNA類型。該系統使用的crRNA和tracrRNA序列模擬的是化膿性鏈球菌的序列，為了提高效率和便于生產，已經對其長度進行了優化。這種系統使用的sgRNA是通過人的RNA聚合酶Ⅲ啟動子U6起始表達的，這個啟動子起始轉錄的第一堿基必須是G。

 

六、 CRISPR-Cas9的實驗流程有哪些？

1. 設計sgRNA：首先需要確定要編輯的目標基因序列，并設計針對該序列的特異性sgRNA（單向導RNA），該sgRNA與Cas9蛋白結合，引導其到目標基因的特定位置進行剪切。（像我們這邊，您可以提供要編輯的目的基因序列，會有對應的合成好的sgRNA挑選）

2. 構建sgRNA-Cas9載體：將sgRNA和Cas9蛋白一起嵌入到一個可自我復制的病毒載體中，以便將sgRNA-Cas9復合物轉入到目標細胞中。

3. 構建sgRNA-Cas9穩轉株：通過將sgRNA-Cas9載體轉染至目標細胞，并經過多輪篩選和擴增，得到穩定表達sgRNA-Cas9的細胞株，即sgRNA-Cas9穩轉株。
（針對這一步。我們有對應的轉染試劑供您挑選）

4. 篩選細胞克隆并進行qPCR驗證：在sgRNA-Cas9穩轉株中篩選出基因敲除成功的細胞克隆，通過qPCR（定量PCR）技術對這些細胞進行基因表達水平檢測，以驗證基因敲除成功。

5. 陽性克隆測序，選擇敲除純合細胞株：對陽性克隆進行全基因組測序，精確檢測基因敲除的位置和大小，并挑選敲除純合細胞株進行下一步實驗。

6. 篩選細胞單克隆測序：在敲除純合細胞株中篩選單克隆細胞，并進行全基因組測序，以確�；�因敲除的準確性和一致性。

除了以上流程，實驗流程可能還包含其他內容，比如在轉染過程中對細胞進行觀察和記錄等。具體的實驗流程可能會根據實驗的目的、條件和要求而有所不同。

 

七、 基因編輯之CRISPR-Cas9技術試劑推薦

1. Dharmacon CRISPR Cas9——無需克隆，任性編輯

① Edit-R Cas9核酸酶，基因編輯成功的關鍵
高效的基因編輯需要Cas9核酸酶有效的表達，為了滿足不同實驗目的和實驗方法，盡可能適應不同的實驗體系，Dharmacon設計不同的Cas9核酸酶表達質粒、Cas9核酸酶mRNA和Cas9核酸酶蛋白，滿足不同實驗對象和實驗環境對啟動子活性、篩選標記和實驗手段的要求，保障實驗的成功率，降低實驗工作量。

1）Cas9 nuclease mRNA
☆ DNA-free系統消除了將不需要的外源DNA整合到宿主細胞基因組的可能性
☆ 熒光標簽Cas9 mRNA（mKate2或EGFP）可富集基因編輯細胞群
☆ 瞬時表達Cas9核酸酶可減少脫靶，獲得更可靠的實驗結果
☆ Cas9啟動子與細胞系間沒有不兼容的問題
☆ 使用DharmaFECT Duo轉染試劑輕松共轉染Edit-R sgRNA和Cas9 mRNA，或電轉染入難轉染的細胞 

 

圖注：三種細胞系中Cas9核酸酶mRNA的基因編輯

 

2）Cas9 nuclease protein NLS
純化的Cas9核酸酶NLS蛋白提供了一種隨時可用的選擇，使研究人員能夠以完全無DNA的方式加速基因編輯實驗

☆ 直接與sgRNA進行共轉染或共電轉
☆ 沒有添加外源DNA到系統中，有效防止質粒DNA進入宿主細胞基因組的可能性   
☆ 啟動子與細胞系間沒有不兼容的問題
☆ 瞬時表達Cas9核酸酶以減少脫靶  

 

圖注：Cas9 protein RNP nucleofection

 

② Edit-R predesigned All-in-one lentiviral sgRNA
☆ 將sgRNA和Cas9核酸酶表達結合成單個載體，簡化遞送  
☆ 提供嘌呤霉素耐藥性和熒光分選標記，可以選擇成功整合載體的細胞
☆ 算法優化保證功能蛋白敲除最大化及脫靶編輯最小化 
☆ 提供甘油菌質粒形式和高滴度純化病毒顆粒形式產品  
☆ 最常用于難轉染細胞類型的敲除，或用于混合慢病毒sgRNA文庫篩選后的后續敲除。  
☆ 建議將EGFP選擇標記用于編輯細胞的快速富集，一旦熒光表達，就可以進行FACS分析。適用于壽命較短的細胞類型，如原代細胞

 

圖注：Edit-R All-in-one慢病毒sgRNA載體示意圖

 

2. 其余試劑推薦

貨號	品名	規格	產品介紹
jetPRIME	101000046	1.5mL	• 通用型DNA/siRNA 轉染試劑 • 卓越的轉染效率：可用于不同來源的貼壁細胞 • 更好的細胞活率：極其溫和的轉染模式 • 性價比高：更少的DNA和轉染試劑使用量 • 操作步驟簡單：血清，抗生素兼容
TransIT-X2® Dynamic Delivery system	MIR6000	1.5mL	• 高效——卓越的廣譜轉染 • 多功能——質粒 DNA、siRNA/miRNA 或核糖核蛋白 (RNP) 復合物的遞送利刃 • 技術——新型非脂質體聚合物遞送
DNeasy Blood & Tissue Kit (50)	69504	50T	從新鮮或冷凍的動物組織和細胞、血液、細菌中提取基因組DNA
QIAamp DNA Mini Kit (50)	51304	50T	從細胞、組織中提取DNA
UCP HiFidelity PCR Kit（100）	202742	100T	高保真PCR Mix
2× Xerox PCR Master Mix	abs60034	1mL	高保真PCR Mix
DNA凝膠/PCR純化試劑盒	abs60098	50次	膠回收試劑盒
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	28704	50T	用于從酶反應中純化回收DNA或者用于膠回收，適用于DNA片段70bp-10kb
T7 Endonuclease I	P7062-1250U	1250U	用于識別錯配DNA、四方向交叉DNA或分支DNA等

 

八、 推薦閱讀
#1：類器官crispr-cas9基因編輯及慢病毒轉染實驗方法

#2：CRISPR基因編輯大招∣安捷倫定制化學合成sgRNA
鏈接：https://mp.weixin.qq.com/s/LYe6Hchq0S9GMIPwbapWhg

#3：分子技術#6：轉染詳解：概念、分類、應用、步驟、細胞類型與常用試劑一網打盡