細胞遷移在許多復雜的生理和病理過程中起著重要作用。傷口愈合測定是研究體外細胞遷移的簡單方法。該測定基于以下觀察：當在匯合細胞單層上產生人工時，所產生的間隙邊緣上的細胞將遷移直至建立新的細胞。ibidi Culture-Insert系列為傷口愈合實驗提供了完整的解決方案，從樣品制備到圖像分析只需要幾個步驟。

 

 

本應用介紹是使用ibidiCulture-Insert 2 Well分析MCF-7細胞遷移行為的詳細方案。

圖1.使用ibidi Culture-Insert 2 Well進行傷口愈合測定的實驗工作流程

ibidi Culture-Insert 2Well放置在細胞培養皿表面上，提供兩個細胞培養容器，每個容室由500μm壁隔開。在兩個儲庫中填充細胞懸浮液僅允許細胞在指定區域生長。細胞附著后移除2孔培養插件，產生大約500μm的無細胞間隙。顯微鏡用于評估傷口愈合過程。根據您感興趣的焦點，可以通過使用視頻顯微鏡或通過在不同時間點觀察圖像來完成。測量細胞覆蓋區域的變化允許量化傷口閉合的速度并提供細胞遷移特征。

實驗工作流程也可以應用于Culture-Insert 3 Well和Culture-Insert 4 Well。唯一的區別是更多的孔和相應的更多的無細胞劃痕。

Culture-Insert 3 Well和Culture-Insert 4 Well

1.  材料

• 細胞：                              MCF-7 (ATCC: HTB-22; DSMZ:ACC115)

• 培養耗材:                  2孔插件放在35毫米的培養皿中，高壁（ibidi，                                                      80206）

• 細胞培養表面：                   ibidi ibitreat

• 細胞培養基：                    RPMI (西格瑪,R8758) = 10% FCS (西格瑪,  F0804)

• 細胞解離溶液：                 胰蛋白酶-ETDA（Sigma，59418C）

• 無菌鑷子

• 倒置顯微鏡，最好具有自動圖像采集系統和用于活細胞成像的鏡載培養箱

 

2.實驗工作流程

步驟1：細胞接種

為了建立可靠的數據采集系統，您必須在開始實驗之前定義實驗參數。這包括例如選擇正確的細胞接種密度。我們建議使用24小時后產生100％光學匯合細胞層的密度。

1. 像往常一樣準備細胞懸液。建議包括離心步驟以去除死細胞和細胞碎片。將細胞懸液調節至合適細胞濃度。在24小時后獲得3×105細胞/ ml以獲得匯合的細胞層。

2. 將70μl細胞懸浮液應用于Culture-Insert2孔的每個孔中。避免搖動μ-Dish，因為這會導致細胞分布不均勻。

3.將細胞在37°C和5％CO2下孵育至少24小時

圖2在ibidi Culture-Insert 2 Well中接種細胞

第2步：間隙形成

匯合細胞層是開始該測定的先決條件。去除Culture-Insert 2孔插件后加入新鮮培養基。如有必要，補充培養基中的抑制或增強物質，以評估其對細胞遷移行為的影響。

1.  在顯微鏡下24小時后檢查細胞密度。如果在24小時后沒有達到匯合的細胞層，則將μ-Dish再次置于細胞培養箱中12-24小時，定期檢查匯合點。

2.用無菌鑷子輕輕取出Culture-Insert 2孔。如圖3所示，從插件的一角移除

圖3使用無菌鑷子去除ibidi Culture-Insert 2孔
 

3  . 移除插入后，檢查您的細胞層是否仍附著在μ-Dish的表面上。

4.  用無細胞培養基或PBS清洗細胞層，去除細胞碎片和非附著細胞。

5.使用推薦體積為2 ml的無細胞培養基填充μ-Dish

圖4由ibidi Culture-Insert 2 Well創建的無細胞劃痕
 

3步：獲取顯微圖像

我們建議錄制延時視頻，以確定時間依賴性和細胞遷移的特征。

1. 將培養皿放在顯微鏡上并移動它直到你有間隙，并在圖像中捕獲兩個細胞前端。使用4x / 5x或10x物鏡。傷口區域的方向并不重要，但需要水平或垂直。

2. 在接下來的幾個小時內多次拍攝圖像，開始觀察過程。

3. 在ibiTreat表面上培養的MCF-7細胞的時間推移測量進行20小時，時間間隔為30分鐘。

圖5使用MCF-7細胞的遷移測定的不同時間測量（比例尺：200μm）
 

步驟4：使用ACAS和數據解釋進行定量圖像分析

 

必須分析顯微照片以獲得關于培養細胞的遷移特征的信息。這可以通過使用圖像處理軟件手動完成，也可以使用自動圖像分析完成自動細胞分析系統（ACAS）由ibidi提供。

使用ACAS分析此處顯示的示例數據。自動圖像分析檢測細胞覆蓋區域。相對于時間繪制細胞覆蓋區域顯示了間隙閉合的過程。線性相可用于表征遷移（=傷口閉合的速度）。

線性相的斜率顯示平均刮擦閉合速度為0.0184×106μm2/小時（= 0.44×106μm2/天）。

 

圖6 ACAS傷口愈合實驗的定量圖像分析

 

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