腦作為人類最復雜的器官，這些不同腦區具有特殊的輸入輸出連接，發揮各種重要的功能。在人腦發育過程中，通過內在基因程序產生了復雜的細胞類型。在這些細胞類型中，有些已經有了明確的特征，但還有許多尚待清晰描述。因此，在人類腦區逐漸特化的發育過程中，腦細胞類型的變化特征和空間分布特點需要進行全面、系統地研究。

近幾年，單細胞轉錄組學研究探索了人腦特定區域以及發育早期的多個區域，同時極少的空間組學研究聚焦于發育早期孕6周（gastrulation week 6，GW6）左右單個時間點的人腦空間圖譜。然而，目前還缺乏對腦發育后期連續時間點的高分辨率空間研究。考慮到人腦體積在發育過程中的急速擴張，這對于探索人腦的發育，特別是區域特化研究提出了巨大的挑戰。

2023年12月12日，中國科學院動物研究所焦建偉研究組、廣州國家實驗室董驥研究組、北京大學杜鵬研究組和北京大學靳蕾研究組合作在Cell雜志在線發表了題為Spatiotemporal transcriptome atlas reveals the regional specification of the developing human brain的文章。該研究將單細胞測序（scRNA-seq）和單細胞空間轉錄組技術（scStereo-seq）相結合，首次解析了迄今為止跨時間點最廣（GW6-GW23）、面積最大(最大4cm x 3cm)的人腦多區域時空發育轉錄組圖譜。

該研究鑒定并呈現了發育早期具有特定空間分布特點的異質性放射狀膠質細胞亞型，揭示了這些異質性放射狀膠質細胞有助于隨后不同腦區神經元的特化，同時發現膠質細胞和神經元互作也會促進神經元的區域特化。利用10x Genomics單細胞測序技術scRNA-seq，作者繪制了來自人類胚胎不同腦區（包括Cor、Dien、Mid、Cere在內），多個發育時間點（GW6、GW8、GW10、GW12、GW14、GW16和GW23）的單細胞轉錄組圖譜 (共228,047個細胞)。根據經典的標記基因，作者鑒定出神經前體細胞（NPC）、谷氨酸能神經元、GABA能神經元、少突膠質細胞前體細胞、星形膠質細胞前體細胞神經外胚層來源的主要細胞類型，以及中胚層來源的細胞類型（如內皮細胞，周皮細胞和小膠質細胞）等。同時，作者使用時空組學技術Stereo-seq，對人腦多個發育時間點（GW6、GW8、GW10、GW12和GW16）進行空間轉錄組測序。通過可視化主要細胞類型的空間分布，本文揭示了發育中人腦不同腦區由不同細胞類型組成的有序分布模式 。
 

人腦時空發育圖譜分析概覽

為了理解人腦中NPC的分子異質性，研究人員用經典標記基因將NPC重新分為五個亞類，包括放射狀膠質細胞（RG）、Cor特異的中間祖細胞（IPC）、Cere特異的顆粒細胞前體（GCP）、前體1（Prec1）和前體2（Prec2）。在五個NPC亞型中，RG最先出現，且在該階段已表現出明顯的區域異質性，其中研究人員發現轉錄因子TFAP2C特異性在人大腦皮層RG中表達并能夠決定大腦RG細胞的命運。接著，研究人員將各腦區的RG細胞進一步分群并觀察空間分布特點。Cor RG分為oRG和vRG，空間可視化后發現oRG在額葉（FL）的比例明顯高于枕葉 (OL); 研究人員將Dien RG分為Dien RG-1和Dien RG-2，其中Dien RG-1高表達DLX1、DLX2，而Dien RG-2高表達TPBG，且發現Dien RG-1主要分布在Dien腹側，而Dien RG-2主要分布在Dien背側；對于Mid RG, 除了Mid RG-4已有研究報導，其他5個亞型均是本研究首次鑒定且均具有獨特的空間分布特點。Cere RG分為4個亞型：菱形唇 (RL)-RG、腦室區 (VZ)-RG、伯明翰膠質細胞 (B glia)、以及腦干RG。其中VZ-RG（GABA能神經元的起源）在GW8和GW10時已經很明顯，而RL-RG（興奮性神經元的來源）在GW10時開始增加，表明小腦不同起源神經元的發育時間差異。空間可視化不僅展示了RG亞型的空間分布，而且為后期神經元區域特化提供了關鍵線索。

為了研究發育中人腦各區域神經元的時空動力學特征，根據差異表達基因，研究人員將62,520個谷氨酸能神經元和59,062個GABA能神經元分別進一步分為17個和20個亞群，并將其中主要亞群映射到空間中。這些神經元亞群表現出明顯的區域異質性和相似性（如發現Cor和Dien的GABA能神經元亞群是高度相似的）。同時，本研究還揭示了Dien谷氨酸能神經元和GABA能神經元亞型存在顯著的背腹側分布差異。另外，研究人員將Cor興奮性神經元進一步細分為遷移神經元、上層神經元以及深層神經元的多個亞型。通過可視化這些亞型，實現了在更廣的時間窗（GW8-GW16）內觀察它們的時空變化特點。這些研究結果揭示了發育中的人腦神經元亞型的時空動態變化和區域多樣性。

為了探索人腦不同區域特定神經元亞群的發育路徑，研究人員通過結合scRNA-seq和scStereo-seq數據，計算并重建了每個區域特定神經元亞群的時空發育軌跡。其中，有趣的是，作者發現Dien RG-1趨向于向LHX6+ GABA能神經元發育，而Dien RG-2趨向于向谷氨酸能神經元發展。同時，空間可視化結果顯示，Dien RG-1和LHX6+ GABA能神經元主要位于Dien腹側，而Dien RG-2和Dien谷氨酸能神經元主要亞群（Glu-3）均主要位于Dien背側，這進一步驗證了單細胞數據分析的結果。上述研究結果有助于更好地理解異質性RG細胞如何對神經元的區域特化做出貢獻。根據差異表達基因和經典標記基因，研究人員接著將GW6-GW23期間不同腦區的少突膠質細胞前體細胞（OPC）和星形膠質細胞前體細胞（APC）分別分為六種和五種亞型，通過比較分析發現它們的腦區分子異質性相對較小，但是，進一步觀察發現這些亞型存在顯著的空間分布偏好。例如，研究人員發現在GW16時，Dien腹側中OPC和APC亞型的比例都高于Dien背側。通過受配體分析發現，這些空間偏好性的分布有助于促進神經元區域特化。

綜上所述，此項研究通過結合單細胞轉錄組和空間轉錄組首次刻畫多時間點、超大面積的人腦多個區域時空發育轉錄組圖譜，為了解人腦發育、神經元的區域特化和相關疾病提供了寶貴的資源，這一突破為助力治療腦疾病提供了線索。同時，值得注意的是，這項研究標志著在激烈的國際競爭中，中國科學家在人腦空間組學研究領域擠進世界第一梯隊。

中國科學院動物研究所焦建偉研究員、廣州國家實驗室董驥研究員、北京大學杜鵬研究員和北京大學靳蕾副研究員為本文共同通訊作者。中國科學院動物研究所博士后李妍昕、博士后李忠秋、廣州國家實驗室助理研究員王長亮、北京大學生命科學學院畢業博士生楊敏為本文的共同第一作者。王雁玲研究團隊參與了項目協作。同時獲得了國家科技部、國家自然科學基金委、中國科學院先導等項目的資助。

研究方法亮點
這項工作刻畫了迄今為止跨時間點最廣、面積最大的人腦多區域時空發育轉錄組圖譜，研究用到了單細胞轉錄組和空間轉錄組等實驗技術。

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文章原文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.11.016