眾所周知，轉錄因子結合在基因啟動子區域調控基因的表達，是基因表達量改變最重要的調控方式。那轉錄因子與靶基因之間的對應關系便成為研究的重點。本期文章我們將為大家帶來如何研究轉錄因子與靶基因之間對應關系的方法，一起來看看吧。

一、啟動子與轉錄因子簡介

啟動子是RNA聚合酶識別、結合和開始轉錄的一段DNA 序列，一般我們研究時默認選擇研究轉錄起始位點上游2000bp作為啟動子區域，因為基因的上游區域通常包含了基因的調控元件，而這些元件的作用范圍一般在2000bp以內。

在轉錄過程中，由DNA產生具有特定編碼信息的RNA轉錄物。為確保基因在不同細胞和組織中表達的特異性，一組特定的蛋白質通過選擇基因來調控轉錄，最終這些基因將被轉錄成RNA轉錄本，這組蛋白質統稱為轉錄因子。轉錄因子具有DNA結合結構域，可與基因啟動子或增強子的特定DNA序列結合，并在激活劑、共因子和RNA聚合酶等的配合下啟動基因轉錄。目前發現，約1600個具有DNA結合結構域的蛋白質是轉錄因子。

在轉錄因子和結合的靶基因關系研究中，要么已知轉錄因子；要么已知靶基因；要么已有報道兩者都知道，想在自己的研究場景中進行驗證兩者的關系。下面我們就分門別類就這幾種情況下的研究方法和思路來做介紹。
二、尋找已知轉錄因子結合的靶基因

如果我們明確知道轉錄因子，想找其靶基因是誰，也就是尋找已知轉錄因子結合的靶基因。首先，在開始正式實驗以前，如果我們可以先進行轉錄因子結合靶基因的預測，那將會大大增加我們內心的安全感和對結果的保證。預測轉錄因子結合的靶基因的數據庫有很多，比如JASPAR數據庫, 通過軟件預測在基因的啟動子序列上是否有對應的motif, 從而識別轉錄因子的靶基因。

又如TRRUST（https://www.grnpedia.org/trrust/Network_search_form.php），我們輸入轉錄因子的名稱后就可以得到其靶基因的信息，如我們在TRRUST數據庫中尋找轉錄因子TEAD1的靶基因，我們把TEAD1輸入到search框中檢索，最終得到如下結果，我們可以看到該轉錄因子的靶基因目前有5個，分別是ATP6V0A2、MSLN、NAIP、PAX3和SRF。在網頁中點擊靶基因的名稱還可以看到該基因的具體信息。


然后，查閱文獻看是否有報道該轉錄因子結合的靶基因。如果有文獻報道，我們想看在我們的研究背景下這種結合是否存在，那可以通過ChIP-qPCR、雙熒光素酶實驗或者酵母單雜交技術來驗證兩者的結合情況。如果沒有文獻報道過該轉錄因子的靶基因信息，那我們可以通過表觀組學手段ChIP-seq或者CUT&Tag技術來分析。這兩種方法的原理一樣，均是使用所研究的轉錄因子的抗體將轉錄因子及與之結合的基因組DNA復合物捕獲下來，后對捕獲得到的DNA片段進行測序，最終分析出轉錄因子結合的靶基因。如果有些轉錄因子沒有合適的抗體，那可以使用加標簽的辦法，把轉錄因子標記后通過標簽抗體進行后續研究。不過研究到此并沒有結束，雜志投稿時還需要后續的驗證數據，一般還需要通過ChIP-qPCR、雙熒光素酶實驗或者酵母單雜交技術等方法來驗證測序結果。

三、尋找調控某個已知基因的轉錄因子

這種情況與上面描述的情況正好相反，我們知道某一個基因，想篩選調控該基因的轉錄因子，那可以通過以下方法來開展。首先，通過網站預測靶基因的轉錄因子。因為轉錄因子結合在基因的啟動子區域，所以要預測該基因的轉錄因子，我們需要先找到該基因的啟動子區域（這個方法在我們以前的一篇公眾號文章“ChIP-qPCR引物設計方法介紹”中有過介紹，這里就不再贅述，可點擊文末的文章鏈接查看~），得到該啟動子序列后我們借助UCSC聯合JASPAR數據庫或PROMO數據庫進行轉錄因子的預測（具體方法大家可以自己搜索一下，或者私信小編具體溝通，這里也不再贅述）。如下圖我們以人的TP53基因啟動子序列為例做的轉錄因子預測結果，轉錄因子個數可通過設置JASPAR數據庫參數來調整。

這些預測只能給我們提供一些參考，如果通過這一步我們能得到明確的轉錄因子，那就可以通過ChIP-seq、CUT&Tag、ChIP-qPCR或者雙熒光素酶實驗等方法進行實驗層面的驗證。如果通過預測我們沒有得到想要的結果，或者我們想通過實驗來篩選，這時我們可以進行DNA pull-down實驗或者酵母單雜交篩庫來實現。該實驗是體外研究DNA-蛋白質相互作用的有力工具。大致原理是對感興趣的DNA序列設計生物素標記的特異性DNA探針，并和與磁珠偶聯的鏈霉親和素結合。將該結合物與細胞核提取物一起孵育后純化與目標DNA片段結合的蛋白質，將該蛋白洗脫后進行后續的WB或者質譜鑒定，從而得到與靶基因結合的轉錄因子。
 
四、轉錄因子和靶基因均未知

在轉錄因子和靶基因均未知的情況下，我們是否可以研究兩者時間的對應關系呢？看到這個問題肯定有些人比較好奇，我們就是研究它們之間的關系，現在兩個都不知道，如何開展研究呢？下面我們說一個研究思路就可以解決這個問題。

我們知道ATAC-seq的測序數據可以分析motif，這時再聯合轉錄組測序數據，通過ATAC-seq的motif分析尋找對應轉錄本相關基因的上游轉錄因子，從而可以挖掘靶基因與對應的轉錄因子，然后可以進一步通過ChIP-seq來驗證前面兩種技術得到的轉錄因子和靶基因的調控關系。

如果在這個過程中我們得到了一個從沒被報道過是轉錄因子的蛋白，那我們需要進行驗證，證明其是轉錄因子。這時可以考慮進行亞細胞定位（轉錄因子發揮作用時位于細胞核中）或者基于酵母雙雜交的轉錄激活驗證。

最后，我們把研究啟動子與轉錄因子結合的實驗設計中常用的幾種方法匯總如下：
 

方法	目的
雙熒光素實驗	驗證啟動子與轉錄因子結合
酵母單雜交實驗	驗證啟動子與轉錄因子結合
酵母單雜交篩庫	篩選已知啟動子結合的轉錄因子
ChIP-qPCR	驗證啟動子與轉錄因子結合
ChIP-seq/CUT&Tag	篩選已知轉錄因子結合的靶基因
DNA pull-down+質譜（蛋白鑒定）	篩選已知啟動子結合的轉錄因子
亞細胞定位	驗證蛋白是否是轉錄因子
酵母雙雜交的轉錄激活實驗	驗證蛋白是否是轉錄因子

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