符合GMP的無異種血清培養基與含血清培養基培養hDPSCs的效果差異對比
人牙髓間充質干細胞(hDPSCs)是臨床治療中較好的細胞來源，具有高增殖能力、多向分化潛能、免疫調節能力等多種優點，hDPSCs一般在含有胎牛血清(FBS)的培養基中進行分離和擴增，但是出于安全性的考慮，迫切需要在符合標準生產規范(GMP)的環境下進行培養，所以選擇一款不含血清的培養基并評價其性能將是至關重要的。
小編今天將帶領大家對比一下符合GMP的無異種血清培養基(AMMS®MSC試劑盒套裝2.0，AS-13）與含血清培養基(SCF)培養hDPSCs的效果差異。
人牙髓間充質干細胞(hDPSCs)來源于9顆正畸牙齒(杭州口腔醫院正畸科)，hDPSCs分別平行在兩種培養基中進行分離與培養，主要通過實驗：集落形成單位(CFU)試驗、流式細胞儀免疫表型分析、三系分化分析、神經細胞定向分化試驗、熒光倒置顯微鏡觀察、實時聚合酶鏈反應、SA-β-gal分析等實驗系統比較了這兩種培養基的細胞特性，包括形態、增殖、標記表達、分化、干細胞、衰老和細胞因子分泌等各項指標。
01 分離與擴增
在兩種培養基中傳代培養的hDPSCs粘附在培養皿的底部，并顯示出典型的紡錘形形態，但AMMS的細胞更細長，P1代SCM和AMMS培養的細胞PDT分別為28.11±4.50h和28.55±3.10h(p=0.625)。隨著傳代的進行，兩種培養基中細胞的PDT逐漸增加，SCM中細胞的PDT增加更快。到P5時，SCM中細胞的PDT顯著升高。側面說明顯示AMMS有更高的分離成功率。
02 CFU
CFU形成是細胞系增殖或自我更新能力的良好指標。在這項研究中，我們計算了P2和P5的hDPSCs形成的細胞集落數。分析表明，在SCM和AMMS培養的hDPSCs之間，以及在相同培養基中培養的P2和P5的hDPSCs之間，CFU形成率沒有顯著差異。在SCM中培養的細胞形成的集落更立體和聚集，而在AMMS中培養的細胞形成的集落扁平、松散和更大。這可能表明在AMMS培養的細胞具有更高的增殖能力。
03 內皮祖細胞的免疫表型
根據ISCT對骨髓間充質干細胞的定義，我們用流式細胞儀檢測了P2和P5的hDPSCs的免疫表型，包括CD73、CD90、CD105、CD45、CD14、CD19、CD34、HLA-DR，>95%，幾乎不表達CD45、CD14、CD19、CD34和HLA-DR<2%。統計分析顯示，在SCM和AMMS中培養的細胞之間的表達百分比沒有顯著差異(所有p> 0.05)，以及在相同培養基中培養的P2和P5的細胞之間沒有差異。
SCM和AMMS培養的hDPSCs免疫表型標志物的表達，陰性對照(綠色)，人類牙髓干細胞；
SCM:含血清培養基； AMMS:無血清/異種培養基（同立海源生物）
04 干性和衰老分析
干性保持是評估細胞質量和細胞制造過程適用性的一個很好的特征。在這里通過實時PCR檢測多潛能標記基因的表達NANOG、OCT4和SOX2。P2和P5的細胞在SCM和AMMS培養的細胞中，這三種基因的表達都沒有表現出任何差異。然而培養至P5時，確實導致了SCM中SOX2的表達(p=0.002)。這些結果可能反映了當細胞在AMMS培養時，干細胞保持得稍好。通過基于SA-β-gal活性的染色來檢測擴增期間的細胞衰老，檢測表明衰老細胞的比例很低(SCM:9.92±2.54%；AMMS:10.03±2.81%)。
分析干細胞相關基因(NANOG，OCT4，SOX2)的表達和傳代培養過程中的細胞衰老
(a) 在P2和P5的SCM和AMMS中培養的細胞之間的相對mRNA表達比較(在P2的SCM中培養的不同基因的表達作為對照)；
(b) SA-β-GAL染色(藍色細胞表示衰老)；
(c) 當在SCM中培養時SA-β-gal陽性細胞與總細胞的比率與P5時AMMS的比較(p=0.97)(比例尺=200微米)；
SCM:含血清培養基； AMMS:無血清/異種培養基（同立海源生物）
05 細胞因子分泌
采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測P5細胞分泌的細胞因子，包括HGF、FGF2、BDNF、GDNF、IL-6、IL-10、PGE2和TGFβ1。結果顯示，與SCM培養的細胞相比，AMMS培養的細胞HGF的表達較高，而PGE2和TGFβ1的表達較低。這些數據表明，與SCM中分離的hDPSCs相比，在AMMS分離的hDPSCs表現出更高的增殖和自我更新能力。
06 體外三系分化潛能
許多研究證明了hDPSCs向骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞的分化能力.茜素紅染色顯示，在兩種培養基中培養的hDPSCs在誘導后顯示出大量的礦物質沉積，但是成骨標記物(ALP和RUNX)是在AMMS擴大的hDPSCs中檢測到的。與先前的研究一致，在SCM中培養的hDPSCs顯示出有限的成脂分化潛能，但在AMMS擴增的hDPSCs表現出更明顯的脂滴染色和更高的標記基因(LPL和PPARγ)成脂誘導下的表達。總的來說，在AMMS擴增的hDPSCs比在SCM中擴增的顯示出更高的成骨和成脂潛能。
P5時在SCM和AMMS中培養的hDPSCs的三系分化潛能
(a)分別用茜素紅、油紅O和阿利新藍染色顯示hDPSCs的成骨、成脂和成軟骨能力；
(b)成骨相關基因(ALP，RUNX2)的相對mRNA表達水平；
(c)成脂相關基因(LPL，PPARγ)的相對mRNA表達水平；
(d)軟骨形成相關基因(ACAN，SOX9)的相對mRNA表達水平(比例尺=200微米，*p<0.05)；
人類牙髓干細胞；
SCM:含血清培養基； AMMS:無血清/異種培養基（同立海源生物）
總結
所以綜合來看，相比SCM，AMMS更有優勢，并且在現行的管理體系下，無血清培養基替換含血清培養基是大勢所趨，不僅提高了細胞培養的可重復性，避免了由于血清批次之間差異的影響，減少了由血清帶來病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險、血清中某些因素對有些細胞的毒性、血清中蛋白對某些生物測定的干擾，更有利于對實驗結果的分析等等。
同立海源AMMS® MSC試劑盒套裝2.0，適用于原代及凍存間充質干細胞的培養擴增，成分明確，穩定性高，操作簡單，無需添加谷氨酰胺，無血清，無異源成分，擴增效率高，表型穩定。產品已通過美國FDA的DMF備案(035589)，干細胞藥物臨床實驗最佳選擇。
參考文獻：
1. JUAN LI, XUEWEI LV, TINGTING GEC, JIAMAN SHI,GIDEON VERWOERD,HAIYAN LIN and YUANSONG YU, Improved Cell Properties of Human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) Isolated and Expanded in a GMP Compliant and Xenogeneic Serum-free Medium.
