葉黃素（Lutein）是人眼部視網膜黃斑部的主要色素。葉黃素對視網膜中的黃斑有重要的保護作用，是幫助眼睛健康發育的關鍵營養元素，人體無法通過自身合成，必須靠攝入葉黃素來補充。若眼睛缺乏葉黃素，會引起黃斑退化和視力模糊，甚至出現視力退化、近視、視網膜病變等癥狀，嚴重的可導致失明。



目前，金盞花是商業葉黃素生產的主要來源。然而，種植成本高、生長環境苛刻等因素在本質上限制了天然葉黃素的進一步開發利用。相比之下，微藻（microalgae）具有生長快、葉黃素含量高、培養環境要求簡單等特點，被認為是天然葉黃素最理想的來源。

 

小球藻(Chlorella sorokiniana)因其優異的生產效率和對不同營養模式和廣泛培養條件的適應性而成為一種有商業前景的葉黃素生物合成菌株。

 

近期，福州大學生物科學與工程學院副研究員謝友坪老師在影響因子為11.4的《Bioresource Technology》雜志中發表了最新的研究成果“High-cell-density heterotrophic cultivation of microalga Chlorella sorokiniana FZU60 for achieving ultra-high lutein production efficiency”。在此研究中，研究人員采用異養培養的方法實現了小球藻FZU60高效生產葉黃素，最后在5L生物反應器（迪必爾生物）上做了放大培養。

結果顯示，通過在補料階段優化營養物組分和濃度的方法，葉黃素的產量和生產速率最高達到了415.93 mg/L和82.50 mg/L/d。本研究提出了一種在藻類細胞中通過補料批次培養策略進行異養培養的方式，可以顯著提高葉黃素的生產性能，具有很大的工業應用潛力。

 

研究路線

 

#1 小球藻FZU60在搖瓶中異養生長性能的過程曲線
 

如圖1a所示，小球藻 FZU60在0-24 h期間處于適應階段，生物量生產速率較低。在24-58 h進入對數生長期，藻類生物量濃度(5.04 g/L)和生產力(2.04 g/L/d)在58 h達到峰值。在58 h之后，生物量濃度和生產速率均有下降，這可能是由于此時碳、氮源枯竭（圖1c），影響了細胞的C/N代謝，阻礙了藻類細胞的生長。

 

如圖1b所示，葉黃素含量隨著孵育時間的延長而增加，在120 h時達到最高水平(4.09 mg/g)。當培養基中碳源和氮源幾乎耗盡，葉黃素仍然在持續合成，可以推斷，葉黃素的合成不需要培養液中可用的氮源和碳源。

圖1 小球藻 FZU60在搖瓶中異養性能的時間過程

(a) 生物量濃度和生產力

(b) 葉黃素含量和生產力

(c) 硝酸鹽和葡萄糖濃度

 

#2 初始細胞濃度(ICC)在搖瓶內對小球藻 FZU60異養生長的影響

圖2 初始細胞濃度對小球藻 FZU60異養葉黃素產量的影響

 

如圖2所示，隨著ICC的增加，小球藻FZU60的生物量生產速率先升高后降低，在ICC為1.40 g/L時達到最大值2.42 g/L/d，葉黃素含量從3.90 mg/g逐漸增加到4.79 mg/g，葉黃素最大生產速率達到最高，為10.71 mg/L/d。說明在一定范圍內增加ICC有利于提高藻類細胞的異養生長速率和葉黃素的生成。因此，確定異養生產葉黃素的最佳ICC為1.40 g/ L。

 

#3 培養溫度對小球藻 FZU60在搖瓶中異養生長的影響

 

從圖3可以看出，小球藻 FZU60的生物量生產速率、葉黃素的含量及葉黃素生產速率在培養溫度從20℃升高到30℃后顯著增加，在30℃時，小球藻的生物量、葉黃素含量和生產速率達到最高，然后隨著溫度進一步升高到40℃均有下降，說明小球藻FZU60異養生長的最佳培養溫度為30℃。

圖3 溫度對小球藻 FZU60異養葉黃素產量的影響

 

#4 在5L發酵罐中提高葉黃素產量的基于營養組分的補料分批策略

圖4 基于營養成分的不同補料策略對小球藻FZU60發酵培養液的影響

(a) 生物量濃度和

(b) 葉黃素含量

 

為了進一步提高小球藻 FZU60異養培養性能，研究了3種基于營養成分組成的補料批次策略(補料批次GN：濃縮葡萄糖(500 g/L)和硝酸鹽(175 g/L)；補料批次MN：濃縮培養基以硝酸鹽為氮源；補料批次MU：濃縮培養基以尿素為氮源)。如圖4a所示，補料批次GN、MN和MU的最大生物量濃度分別為16.07、54.71和98.40 g/L。補料批次MU的生物量濃度顯著高于補料批次GN和MN。補料批次MU的生物量生產速率達到17.96 g/L/d，分別比補料批次GN和MN高231.98%和59.36%(表1)。
 

表1 基于營養成分不同的補料策略下小球藻 FZU60異養性能比較

如圖4a所示，補料批次MN和MU的葉黃素含量從24 h到96 h逐漸增加，96 h后變化不大，而補料批次GN的葉黃素含量在24-72 h時約為2.30 mg/g，隨后急劇下降。最值得注意的是，補料批次MN的葉黃素含量始終超過補料批次GN和MU，且順序為補料MN >補料MU >補料GN。

 

然而，由于生物量濃度和生產力較高，補料批次MU的葉黃素產量和生產力分別達到289.20 mg/L和56.93 mg/L/d，高于補料批次GN和MN(表1)。綜上所述，補料批次MU是一種非常有效的提高小球藻FZU60異養生長性能的補料策略。

 

#5 基于營養濃度的5 L發酵罐高效生產葉黃素的批次補料策略

 

基于營養成分不同的補料策略研究結果表明，與補料GN和MN相比，補料MU的葉黃素產量和生產力更高。接下來以尿素為氮源，研究了三種不同營養濃度的培養基補料策略(補料批次1F：濃縮1倍；補料批次3F：濃縮3倍；補料批次6F：濃縮6倍)。
 

圖5 基于營養物質濃度不同補料批次策略下小球藻 FZU60發酵培養液的影響。

(a) 補料批次1F

(b) 補料批次3F

(c) 補料批次6F

 

如圖5所示，補料批次3F的最高生物量濃度在144 h達到186.86 g/L，分別比補料批次1F和6F提高了102.76%和44.83%，且順序為補料3F >補料6>補料1F。在整個培養過程中，補料批次1F的葉黃素含量從1.67 mg/g逐漸增加到4.09 mg/g。高于補料批次3F和6F策略的葉黃素含量，表明低濃度的營養成分有利于葉黃素在藻類細胞中的積累。這可能是由于底物的周期性和頻繁限制引起的應力效應。然而，補料批次3F獲得了極高的生物量濃度（161.82 g/L）、生物量生產速率（32.10 g/L/d）、葉黃素產量(415.93 mg/L)和葉黃素生產速率(82.50 mg/L/d) (表2)，分別比1F/6F飼料批次高51.88%、63.17%、52.98%和63.79%。

 

表2 基于養分濃度的不同投料策略下小球藻 FZU60異養性能比較
參考文獻：Xie Y, Zhang Z, Ma R, et al. High-cell-density heterotrophic cultivation of microalga Chlorella sorokiniana FZU60 for achieving ultra-high lutein production efficiency. Bioresource Technology. 2022 Dec; 365:128130. doi: 10.1016/j.biortech.2022.128130.

 

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關于實驗設備

文中提到的反應器是來自迪必爾生物的Intelli-Ferm A/B/Q 系列臺式發酵罐（圖6、圖7）
 

圖6 Intelli-Ferm A 臺式發酵罐
 

圖7 Intelli-Ferm B 臺式發酵罐

 

該反應器罐體（玻璃、一次性）體積覆蓋3L-15L，不僅滿足細菌、真菌的高密度培養，還可進行小球藻（Chlorella soroiniana）、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、雨生紅球藻(Haematococcus Pluvialis)等微藻類植物細胞的高密度培養（圖6c）。

 

此外，為了滿足微藻類植物細胞的光自養、異養和混養三種模式，迪必爾生物對該系列生物反應器進行升級，開發出了T&J-Lux A攪拌式光照生物反應器（圖7）。
 

圖7 T&J-Lux A攪拌式光照生物反應器

 

反應器內置紅、藍、綠三種不同顏色的光源，可實現最高50000Lux的光照強度。與硬件匹配的軟件系統整合了光亮等級分步設計，可進行光亮參數梯度調節，同時可進行光暗比的循環控制，滿足不同微藻類植物細胞對光色類別、光色比例、光照強度和光暗周期等工藝參數的調整。