Fig 1. 橫跨六個腦區的腦血管特征

2. AD患者細胞類型特異性腦血管改變
為了研究血管基因表達與AD之間的關系，基于單細胞的方法結合不同腦區域所有細胞類型的細胞，在AD患者和對照組之間鑒定了2676個AD DEGs（adDEGs）。通過排列分析，adDEGs的數量顯著高于的預期，并在pseudobulk水平得到證。其中，2142個僅為一種細胞類型所特有。值得注意的是，cEndo細胞具有最高數量的adDEGs，cEndo功能中轉錄差異的重要性與AD病理相關。

其中，細胞連接相關和粘附相關基因，包括APOD、PECAM1和COLEC12；包括SLC38A2、SLC2A1和SLC6A1在內的轉運蛋白，以及與固醇輸入相關的基因，包括RORA、PRKAA2和PPARG，表明血管細胞類型的這些基本功能可能是AD 中可能存在失調。正如預期的那樣， AD樣本的PERs中PDGFRB的陽性率，暗示PERAD1,13中BBB完整性的損傷和功能障礙。ABCB1基因在cEndo細胞中明顯下調。細胞數量最多的三種細胞類型（cEndo，PER1和FIB1）顯示出最大的重疊。

對adDEGs進行GO富集分析表明，多種廣泛的功能途徑在細胞類型之間是共享的，這表明AD中的轉錄變化在通路水平上富集到共同的功能；然而，許多途徑更具細胞類型特異性。

CD31+血管片段在個體AD中具有較高的INSR1轉錄密度。發現AD大腦中CD31+內皮細胞的子集具有較高密度的INSR+。這些表明內皮細胞的不同亞群可能表達不同水平的胰島素受體，使細胞對胰島素信號的敏感性增強或減弱。編碼高密度脂蛋白（HDL）成分的APOD在AD壁細胞中上調，這與以前報道的APOD在AD中的上調一致。為了驗證AD PER中APOD的上調，使用原位雜交定量GRM8標記細胞中的APOD轉錄豐度，并觀察到在患有AD的個體中GRM8+ PERs具有較高的APOD表達。PER中APOD上調的功能后果以及對神經血管單元內脂質轉運的影響將成為未來研究的基礎。此外，驗證了SLC6A1在AD PER中的下調，以及COL4A1在AD的血管內皮細胞中的上調。
 

Fig 2. AD中細胞類型特異性腦血管改變

3. AD中DEGs的上游調控因子
鑒定了118個上調adDEG的上游調節因子和81個下調adDEG的上游調節因子，其中66個靶向各種細胞類型中上調和下調的adDEG。這133個調節因子中有17個是相應的差異表達基因。當這些調節因子顯示出目標基因的顯著共享時，定義為共調節模塊（定義為tfModules）。對于cEndo中上調的adDEG，鑒定了7個tfModule，包括38個調節因子，以及11個不在tfModules中的調節因子。同一tfModule中的調節因子通常具有相關功能。 在每個tfModule中，調節因子具有各自靶基因數量、在AD中的差異表達以及靶基因的差異表達。并非每個tfModule中的所有調節因子都是DEG，這表明一些調節因子可能通過與差異表達的調節因子的協作發揮作用。

使用這些tfModules將目標adDEG分為由不同tfModule組合介導的亞組。對于cEndo上調的adDEG，發現由單一tfModule靶向的群體和其他由多個tfModules靶向的群體，具有獨特的共同功能富集。相反，G1中的adDEG是由大多數tfModules（M1-M4、M6）的調節因子靶向的，并顯著富集在細胞因子反應、細胞粘附和轉錄調控中。幾個群體中的基因（G3、G7、G8）富集在抑制內皮細胞增殖和凋亡信號通路的表達上，這表明在AD中存在內皮細胞損傷反應，這與BBB破壞一致。
 

Fig 3. AD中DEGs的上游調控因子

4. AD細胞間通訊動力學
通過分析跨越409個個體的基因模塊（定義為degModules）的協變分析，預測了細胞之間的雙向通信。發現了301個在AD中上調的相互作用，其中相互作用的degModules在AD中均顯示上調。來自PER1和cEndo細胞到神經元、小膠質細胞和星形膠質細胞的通信在AD中占主導地位，而來自星形膠質細胞和神經元到cEndo細胞和FIB1s的通信在AD中主要減少。

為了表征這種差異細胞間通信的配體-受體信號通路，將由相同配體-受體對介導的單個相互作用聚集起來。TGFβ、SPP1、BMP、ANGPTL和IL-6介導的信號通路在AD增加的相互作用中顯著高表達，而膠原蛋白和層粘連蛋白是形成BBB基底膜的主要細胞外基質（ECM）蛋白，其在AD減少的相互作用中高表達，這表明AD中BBB結構被破壞。

排列測試發現大多數雙向細胞間相互作用的變化在AD中每種細胞類型對之間都是顯著的，這表明AD中失調的基因與多細胞相互作用高度相關。接下來，將每個細胞類型對之間的雙向AD差異細胞間相互作用分為正向和反向方向，并對它們進行了量化。cEndo和PER1細胞以及興奮性神經元和星形膠質細胞之間的相互作用最多。為三個細胞-細胞對（cEndo-Ex、cEndo-Astro和PER1-Ex）構建了配體-受體網絡，以突出特定的配體-受體信號通路。BMP6介導PERs（PER1）和興奮性神經元（Ex）之間AD增加的相互作用，表明其在PER中控制神經發生受損的作用。星形膠質細胞和cEndo細胞之間由表皮生長因子（EGF）信號通路介導的AD減少的相互作用表明，在AD中抑制了cEndo的增殖。
 

Fig 4. AD全基因組關聯研究基因座與腦血管病相關

5. AD全基因組關聯研究基因座與腦血管病相關
將AD相關的位點與adDEG整合在一起，以預測其候選靶基因和作用方向，其作用的細胞類型以及它們可以直接或間接導致血管基因表達變化的機制。197個AD相關變異位于113個位點，它們接近125個血管adDEG，顯示出細胞類型特異性表達變化。大多數adDEG在其內含子（54.3%）或緊鄰上游或下游且無介入基因（7.13%）中攜帶AD相關變異，或者根據不同證據相互關聯。這些AD相關的adDEG富集在多個過程中，包括膽固醇運輸、調節內皮細胞遷移和IL-6介導的信號。21個GWAS位點與脂質和膽固醇代謝adDEG基因相關聯，這與AD中廣泛失調的腦膽固醇穩態是一致的。

9個AD GWAS位點與免疫反應、胰島素分泌和神經退行性病變有關，包括IL6和IL6R，它們在AD患者的cEndo細胞中高表達，提示內皮細胞的免疫反應可能是AD血管的一個突出特征。
 

Fig 5. AD全基因組關聯研究基因座與腦血管病相關
 

尋找間接遺傳證據以證明血管adDEG的上游調節器直接與AD相關變異（轉錄調控）相關聯。使用了之前注釋的相關模塊對（degModules），并搜索了AD相關遺傳位點的adDEG配體，以尋找潛在的遺傳效應。發現了54對（24個上調和30個下調在AD中），其配體靠近AD相關遺傳位點，涉及611個與12個AD相關配體和13個受體（18個不同的配體-受體對）相關聯的血管adDEG。這12個AD相關配體代表了比預期更顯著的富集。其中7個配體顯示了單細胞表達數量性狀位點（sc-eQTL）連接證據，3個顯示了組織水平腦eQTL證據，7個顯示了Hi-C環連接證據。其下游基因至少富集在17種不同的生物學功能中。總之，使用順式、轉錄或細胞間信號調節機制，AD中的2676個血管adDEG中有1010個可以與AD遺傳關聯。這表明遺傳風險因素對腦血管的影響可能有助于AD的發病機制，這是通過腦血管細胞類型和大腦實質神經、膠質和巨噬細胞以及外周血中的免疫細胞的細胞內功能障礙和細胞間通訊實現的。
 

Fig 6. AD GWAS基因與腦血管adDEGs間接相關

6. APOE基因型與血管細胞認知功能下降
2482個apoeDEG在細胞類型中的分布大體均衡（平均而言，120個APOE4上調和120個APOE4下調），并且數量與adDEG相似。雖然只有中位數為4%的APOE差異基因與AD差異基因重疊，但apoeDEG與adDEG之間的重疊對于一些細胞類型來說具有重要意義。對于cEndo細胞，36%的apoeDEG上調基因也是adDEG上調基因，21%的apoeDEG下調基因也是adDEG下調基因。FIB1和PER1細胞中發現了強有力的apoeDEG-adDEG一致性（十倍至十四倍富集），而PER2和vEndo上調基因的一致性較弱（六倍至八倍）。

搜索了每個細胞類型中上調和下調的apoeDEG所富集的生物學途徑。在cEndo細胞中，下調的apoeDEG（E4-down）顯著富集在跨BBB運輸、細胞連接組織以及調節芽生血管生成中。在PERs中，下調的apoeDEG富集在細胞遷移調節、跨BBB運輸以及細胞-細胞連接維持中，這與APOE ε4個體表現出腦血流量減少和腦血管異常增加的報道一致。評估了所有apoeDEG與認知衰退的相關性，發現上調的apoeDEG（E4-up）與所有細胞類型的認知衰退相關，而下調的apoeDEG（E4-down）主要與認知恢復相關。這種效果在cEndo、vEndo、FIB1和PER1細胞中最為明顯，E4-up和E4-down基因在認知衰退相關性方面存在實質性和高度顯著差異。結果與之前的研究結果一致，cPERs可能介導APOE4對認知衰退的影響，并表明cEndo和FIB1細胞可能具有同等甚至更重要的作用。

進一步鑒定了APOE基因型條件性的、與認知衰退相關的差異表達基因（cogDEG），區分了‘認知衰退上調’cogDEG和‘認知衰退下調’cogDEG。前者與認知衰退呈正相關，后者與認知衰退呈負相關。APOE4個體比APOE3個體表現出更多的cogDEG（超過1.5倍），特別是在cEndo、vEndo、PER1和FIB1細胞中，尤其對于認知衰退上調基因（2.1倍），這表明特定的腦血管細胞類型可能介導APOE ε4等位基因對認知衰退的貢獻。比較APOE3與APOE4 cogDEG，發現這兩組基因大部分不同，只有約5%的cogDEG在APOE4和APOE3之間是共同的，這表明ε3和ε4攜帶者在轉錄變化和認知衰退的具體機制上存在差異。

為了進一步研究APOE基因型條件性的cogDEG的功能，在毛細血管細胞類型（cEndo和PER1）中對E3特異性的、E4特異性的和E3-E4共享的cogDEG進行了GO富集分析。對于cEndo認知衰退上調的cogDEG，APOE4特異性富集包括脂質和細胞因子反應以及細胞凋亡過程；APOE3富集包括血管運輸、細胞遷移的負調節和細胞基質粘附。對于cEndo認知衰退下調的cogDEG，APOE4特異性富集包括血管發育、BMP信號的調節和神經遞質轉運；APOE3富集包括內皮細胞遷移的正調節和細胞外結構組織。對于PER1認知衰退上調的cogDEG，APOE4特異性富集包括細胞因子反應、細胞-細胞連接組裝和細胞凋亡；APOE3富集包括SMC遷移的負調節和Notch信號，以及自噬。對于PER1認知衰退下調的cogDEG，APOE4特異性富集包括BBB相關功能（BBB維持、Notch信號、收縮調節），而APOE3富集包括脂質和化學穩態以及細胞連接組裝，這表明APOE ε4依賴的認知衰退可能主要由PER1 PERs介導。
 

Fig 7. APOE4-相關的轉錄變化和認知能力下降

參考文獻：
Sun N, Akay LA, Murdock MH, Park Y, Galiana-Melendez F, Bubnys A, Galani K, Mathys H, Jiang X, Ng AP, Bennett DA, Tsai LH, Kellis M. Single-nucleus multiregion transcriptomic analysis of brain vasculature in Alzheimer's disease. Nat Neurosci. 2023 Jun;26(6):970-982. doi: 10.1038/s41593-023-01334-3. Epub 2023 Jun 1. Erratum in: Nat Neurosci. 2023 Oct 31;: PMID: 37264161; PMCID: PMC10464935.